銀杏葉提取物抑制腎間質(zhì)纖維化作用研究

溫 泉，荘健春，張 紅，張永凱

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

腎間質(zhì)纖維化是幾乎所有腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎功能衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，是各種慢性腎病的共同轉(zhuǎn)歸。腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能受損程度高度相關(guān)，有效抑制和/或延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，對(duì)腎臟功能的保護(hù)和延緩各種慢性腎病進(jìn)展起重要作用，直接關(guān)系到慢性腎臟病患者的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是最重要的腎間質(zhì)纖維化相關(guān)的生長(zhǎng)因子，多種原因引起的腎纖維化均可見(jiàn)其高表達(dá)，且其表達(dá)量也與腎間質(zhì)纖維化程度高度相關(guān)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是TGF-β的下游因子，是由TGF-β激活后的早期即刻表達(dá)因子，與TGF-β相比，CTGF促組織器官纖維化效應(yīng)特異性更高，抑制TGF-β/CTGF通路對(duì)多種器官纖維化的防治可能具有重要意義。由于中醫(yī)藥可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮其保護(hù)腎功能、抑制或延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程等作用，在腎間質(zhì)纖維化的治療中顯示了特有的優(yōu)勢(shì)。有研究顯示，銀杏葉提取物(GBE)可抑制體外培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的TGF-β1和CTGF mRNA過(guò)表達(dá)[1]。唐錦輝等[2]用GBE預(yù)防性治療大鼠實(shí)驗(yàn)性腎小球硬化，發(fā)現(xiàn)GBE可以明顯減輕殘腎系膜區(qū)ECM積聚，降低腎小球硬化指數(shù)，明顯減少腎臟組織中輕脯氨酸含量，并明顯減輕腎小管間質(zhì)細(xì)胞的增殖。本研究擬以單側(cè)輸尿管結(jié)扎法(UUO)復(fù)制大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，同時(shí)用GBE進(jìn)行干預(yù)，探討GBE防治腎間質(zhì)纖維化效果及其機(jī)制，為中藥治療腎間質(zhì)纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

銀杏葉片(批號(hào):20151209)購(gòu)自貴州信邦制藥股份有限公司；鹽酸貝那普利片(批號(hào):15083)購(gòu)自北京諾華制藥有限公司；羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒(A030)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；免疫組化染色試劑盒(PV-6000)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)多克隆抗體為北京中杉金橋生物工程公司產(chǎn)品；兔抗大鼠TGF-β1(A2124)和CTGF(A11943)抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；TRIzol、二步法逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(AQ201)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 造模及分組

Wistar大鼠，雄性，體重180-200 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(Liao)2015-0001)，于吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)得到了動(dòng)物管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，且經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(UUO組)、銀杏葉治療組及貝那普利治療組，每組6只大鼠。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，無(wú)菌條件下行腹正中偏左縱切口進(jìn)入腹腔，游離左側(cè)輸尿管，在靠近腎門(mén)處及輸尿管下段分別結(jié)扎，并從中間剪斷輸尿管，逐層縫合腹壁及皮膚。假手術(shù)組只單純分離但不結(jié)扎和剪斷輸尿管即關(guān)閉腹腔。

1.3 給藥方法

自造模后第2天起各組動(dòng)物開(kāi)始給藥。銀杏葉治療組以150 mg/kg體重銀杏葉注射液腹腔注射，貝那普利治療組以15 mg/kg體重鹽酸貝那普利片混懸液灌胃，UUO組和Sham組給予等體積生理鹽水灌胃，每日一次。給藥2 w后，各組大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，迅速取左側(cè)腎臟，上1/3于-20℃、下極1/3于-80℃貯存，中段1/3固定于10%中性甲醛緩沖溶液。

1.4 羥脯氨酸含量測(cè)定

取100 mg大鼠腎臟組織，按照羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)以堿水解法進(jìn)行羥脯氨酸含量測(cè)定。大鼠腎組織羥脯氨酸含量以μg/mg組織濕重計(jì)。

1.5 免疫組化檢測(cè)

用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠心肌組織糜酶表達(dá)量。主要操作步驟：石蠟包埋腎組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，置于pH6.0枸椽酸緩沖液中以微波加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，加適量一抗(抗TGF-β1和CTGF抗體稀釋比例為1∶200和1∶300)4℃孵育過(guò)夜，次日以適量酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育20 min后用適量新鮮配制的DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染后脫水、透明、返藍(lán)，用ImageJ1.52分析染色陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)強(qiáng)度(IOD)。

1.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

采用相對(duì)定量實(shí)時(shí)定量RT-qPCR法檢測(cè)各組大鼠腎臟組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)。主要操作如下：按TRIzol說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠腎臟組織進(jìn)行總RNA提取。按二步法逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μl，含總RNA 1 μg，5XTransScript○RAll-in-one SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，經(jīng)45℃孵育15 min，85℃孵育5 s以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶和gDNA Remover。PCR體系總體積為20 μl，含mRNA模板 1 μl，上、下游引物各0.2 μl，2XTransStart○RTip Green qPCR SuperMix for qPCR 10 μl，94℃ 30 s預(yù)熱后，經(jīng)94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃共40個(gè)循環(huán)。TGF-β1引物序列上游：5′-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3′，下游：5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAA-3′；CTGF引物序列上游：5′-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3′，下游：5′-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′。以2-ΔΔCT表示糜酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCT=(CTchymase-CTGAPDH)experiment-(CTchymase-CTGAPDH)control[3]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎纖維化程度比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠狀態(tài)良好，對(duì)照組大鼠雙側(cè)腎臟對(duì)稱(chēng)，體積及重量均無(wú)明顯改變，其余各組大鼠左側(cè)腎臟體積明顯增大，腎盂內(nèi)大量尿液潴留，腎皮質(zhì)變薄。羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織羥脯氨酸含量均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎組織羥脯氨酸含量比較，差異無(wú)顯著性，但均明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎組織羥脯氨酸含量表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腎間質(zhì)即有少量TGF-β1和CTGF表達(dá)，圖像分析結(jié)果顯示，模型組大鼠左側(cè)腎間質(zhì)TGF-β1和CTGF表達(dá)量均明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而二者在銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎間質(zhì)表達(dá)量差異無(wú)顯著性，但均明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2和表2。

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.銀杏葉治療組；D.貝那普利治療組

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.銀杏葉治療組；D.貝那普利治療組

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF免疫組化結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠左側(cè)腎組織TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而二者在銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎組織表達(dá)量差異不顯著，且均明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

銀杏(Ginkgo biloba L.)為銀杏科、銀杏屬落葉喬木，其葉和果有重要藥用價(jià)值。大量研究顯示，GBE具有擴(kuò)血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、及抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用，已廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病的預(yù)防和治療。趙艷玲等[4]發(fā)現(xiàn)，GBE可明顯抑制馬兜鈴酸腎病大鼠血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平，并抑制腎組織中TGF-β1和CTGF的表達(dá)，表明GBE對(duì)馬兜鈴酸致腎纖維化有一定防治作用。劉曉剛等[4]研究顯示，GBE可減少腎病綜合征大鼠尿蛋白量，并降低其血脂水平。李相軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，給UUO大鼠口服GBE 2周后，GBE組大鼠NAG酶活性、尿肌醉、血尿素氮及血肌醉較UUO組均顯著降低，24 h尿蛋白排出量亦明顯下降，說(shuō)明GBE對(duì)腎臟功能具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GBE可明顯抑制UUO引起的大鼠腎間質(zhì)羥脯氨酸含量，表明GBE可抑制或延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF免疫組化結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

TGF-β是一種強(qiáng)效的致纖維化因子，在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中多個(gè)環(huán)節(jié)中均起重要作用。CTGF作為T(mén)GF-β下游因子，具有更明顯的促進(jìn)腎臟間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌作用。有研究表明，UUO大鼠術(shù)后第1天即有腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)升高，而CTGF mRNA及蛋白表達(dá)量于UUO術(shù)后第3天開(kāi)始升高直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(14 d)，與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)，表明CTGF高表達(dá)是腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的重要驅(qū)動(dòng)因素之一[7]。因此，CTGF與TGF-β相互促進(jìn)，形成正反饋，并通過(guò)TGF-β/CTGF/ECM通路參與腎間質(zhì)纖維的形成和發(fā)展。本研究用免疫組化法及實(shí)時(shí)定量RT-PCR法均證實(shí)，應(yīng)用GBE 2周后，TGF-β1及CTGF在腎間質(zhì)中表達(dá)明顯減少，其mRNA表達(dá)量亦明顯低于UUO模型組大鼠，結(jié)果表明，GBE延緩腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制與其抑制TGF-β1/CTGF通路有關(guān)，這可能是GBE的治療靶點(diǎn)之一。