左旋精氨酸對eNOS在大鼠實驗性牙移動中表達(dá)影響的研究

李 慧,李 佳,汪 洋,李明賀

(1.首都醫(yī)科大學(xué)密云教學(xué)醫(yī)院 口腔科,北京101500；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 頜面外科,吉林 長春130041；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，吉林 長春130041)

正畸的核心是牙移動[1]，實現(xiàn)牙移動則需要通過牙周組織的改建，包括血管改建和骨改建，而牙齒移動速度和正畸矯治療程便取決于牙周組織的改建水平。對其機制的研究以及方法的實現(xiàn)對口腔正畸臨床工作具有重要的意義。對此諸多學(xué)者做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)慕o藥、加入細(xì)胞因子以及物理方法的使用等將會促進(jìn)牙周組織改建，即對正畸臨床提供加速牙移動的方法，但仍處于探索階段。以往有研究表明，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)參與正畸牙移動牙周組織改建[2]。本研究旨在通過建立大鼠實驗性牙移動模型，注射一氧化氮(nitric oxide，NO)前體左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)，觀察eNOS在牙周組織中的表達(dá)，研究在實驗性牙移動牙周組織的血管改建和骨改建中eNOS和NO如何發(fā)揮作用，從而進(jìn)一步闡釋實驗性牙移動牙周組織改建的機制，并為L-Arg的相關(guān)臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。目前對此尚未見有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

取40只健康的6周齡雄性Wistar大鼠，體重為(0.15±0.02)kg，(由吉林大學(xué)動物實驗室提供)。隨機分為實驗組與對照組各20只，實驗組與對照組按文獻(xiàn)[3]描述建立實驗性牙移動動物模型(置NiTi螺簧于大鼠右上第一磨牙和上頜切牙之間，支抗牙為上頜切牙，拉右上頜第一磨牙以50 g的力，使其向近中移動)，加力后立即對實驗組大鼠用L-Arg(300 mg/kg/d[4]在0.5 ml生理鹽水中溶解)行腹腔注射，對照組用等量的生理鹽水注射，1次/天。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗eNOS多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組織化學(xué)SP試劑盒(福州邁新公司)；L-Arg(美國 Sigma 公司)；XL-I型正畸測力計(西北工業(yè)大學(xué))。

1.3 標(biāo)本制作

應(yīng)用經(jīng)1‰DEPCS水處理過的4%多聚甲醛在加力注射后的1、3、5、7、14天經(jīng)心臟灌注分別處死兩組動物各4只。制作牙周組織和牙的聯(lián)合標(biāo)本，經(jīng)過固定過夜、脫鈣、脫水及石蠟包埋，制作5 μm厚的組織切片，其為近遠(yuǎn)中方向、以右上頜第一磨牙為中心。常規(guī)HE染色作組織的定位參照片，以代替一抗的PBS作為陰性對照，行SP法免疫組織化學(xué)染色以eNOS為一抗(1∶200)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.4 鏡下觀察及圖像分析

1.4.1eNOS陽性反應(yīng)灰度積分 在eNOS染色之后，隨機選取3張從每組標(biāo)本的切片中，光鏡下對比觀察對照組與實驗組eNOS表達(dá)陽性區(qū)域的分布。隨機選5個非重疊視野(×200)從每張切片中以測定eNOS陽性反應(yīng)強度灰度，轉(zhuǎn)化為灰度積分=陽性產(chǎn)物面積/測量面積×陽性強度灰度值。

1.4.2新生血管計數(shù) 按照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)Weidner方法[5]，首先查找血管密集區(qū)于低倍鏡下，再將每個視野中的微血管數(shù)于高倍視野下(×200)計數(shù)：即微小血管由2-3個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇構(gòu)成，而以下情況均不計數(shù)：達(dá)8個紅細(xì)胞大小的血管，管腔帶有較厚肌層或由5個以上內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成管腔。隨機選5個非重疊視野，測定值取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

2.1.1HE染色 實驗組與對照組相似，因機械牽拉牙周膜分為壓力側(cè)和張力側(cè)，壓力側(cè)牙周膜纖維排列紊亂；張力側(cè)牙周膜纖維排列具有方向性。而實驗組可見更為豐富的微血管。

2.1.2eNOS免疫組織化學(xué)染色 eNOS免疫組化染色呈棕黃色顆粒的為陽性表達(dá)，實驗組和對照組各時間點均有不同程度陽性表達(dá)，強度隨著時間呈一定的變化規(guī)律。對照組陽性強度普遍低于實驗組，實驗組在血管上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞均有不同程度陽性表達(dá)。

1天組：

對照組：張力側(cè)牙周膜增寬，血管相對擴張。壓力側(cè)牙周膜變窄，血管部分受壓，管腔形態(tài)不規(guī)則或呈梭形。eNOS在部分血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)呈陽性(++)，骨細(xì)胞中未見明顯表達(dá)(±)，成纖維細(xì)胞表達(dá)呈弱陽性(+)。牙槽骨改建反應(yīng)未見(圖1)。

圖1 對照1天組牙周組織eNOS的表達(dá)(SP,×100)

實驗組：與對照組反應(yīng)基本相似。牙骨質(zhì)表面的成牙骨質(zhì)細(xì)胞可見。

3天組：

對照組：張力側(cè)牙周膜明顯增寬，血管繼續(xù)擴張。壓力側(cè)牙周膜變得紊亂，血管腔隙甚至閉塞在狹窄部分(圖2)。eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)呈強陽性(+++)， 在成骨細(xì)胞中也有陽性表達(dá)(圖3)。

圖2 對照3天組牙周組織(HE,×100)

圖3 對照3天組牙周組織eNOS的表達(dá)(SP,×100)

實驗組：較對照組新生血管數(shù)目多?？梢姷焦俏蘸蟮墓窍莞C，同時新骨在牙槽骨表面可見形成(圖4)。eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)呈強陽性(+++)，與比對照組相比增強(圖5)。

圖4 實驗3天組牙周組織(HE,×100)

圖5 實驗3天組牙周組織eNOS的表達(dá)(SP,×100)

5天組：

對照組：張力側(cè)血管擴張增生，成骨細(xì)胞成排排列， 新骨沉積于牙槽骨表面。壓力側(cè)可見新生的毛細(xì)血管，牙槽骨表面多個破骨細(xì)胞，骨吸收陷窩明顯，各類細(xì)胞eNOS表達(dá)均略有降低。

實驗組：形成更多新生的毛細(xì)血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞等eNOS呈強陽性(+++)染色，與對照組相比明顯增高(圖6)。

圖6 實驗5天組牙周組織eNOS的表達(dá)(SP,×100)

7天組：

對照組：張力側(cè)可見數(shù)目較多的成骨細(xì)胞，鑲邊樣或成排排列分布于新骨表面。血管擴張，新生血管大多分布于新生的牙槽骨周圍。壓力側(cè)可見較豐富的新生毛細(xì)血管，骨吸收明顯。各類細(xì)胞的eNOS表達(dá)強度都呈明顯降低(圖7)。

實驗組：張力側(cè)可見旺盛的新生血管，數(shù)目增多明顯；牙周膜較寬，牙槽骨可見增生反應(yīng)明顯。壓力側(cè)可見豐富的新生血管，有較小的管腔；牙周膜較窄，牙槽骨表面可見吸收較明顯(圖8)。血管內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的eNOS染色呈更強的陽性反應(yīng)較對照組(圖9)。

圖7 對照7天組牙周組織eNOS的表達(dá)(SP,×100)

圖8 實驗7天組牙周組織(HE,×100)

圖9 實驗7天組牙周組織eNOS的表達(dá)，新生血管數(shù)目較多(SP,×100)

14天組：

對照組：張力側(cè)新生牙槽骨已連成片在某些區(qū)域，可見成骨細(xì)胞分布于其表面。牙槽骨內(nèi)與牙周膜仍見較多的新生血管，大多靠近于新生的骨組織。壓力側(cè)牙周膜逐漸恢復(fù)寬度， 血管也恢復(fù)正常形態(tài)，破骨減弱(圖10)。血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞eNOS呈弱陽性表達(dá)(+)。

實驗組：與對照組反應(yīng)類似，可見較多的新生血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等eNOS表達(dá)呈弱陽性(+)。新生骨分布已成片，破骨活動少見。

圖10 對照14天組牙周組織(HE,×100)

2.2 圖像分析

2.2.1實驗性牙移動牙周組織中eNOS免疫組化染色的圖像分析 受力后第1天，實驗組與對照組牙周組織中eNOS表達(dá)無明顯差異，自第3天，實驗組高于對照組(P<0.05)。高峰均在牙齒受力后第3天出現(xiàn)。見表1。

表1 實驗組與對照組eNOS陽性反應(yīng)平均灰度積分的比較

注：P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

2.2.2實驗性牙移動牙周組織中的新生血管計數(shù) 正畸加力后的不同天數(shù)，實驗組與對照組新生血管數(shù)量的變化規(guī)律相似，均于受力后第7天出現(xiàn)高峰。在加力第3天-第7天時實驗組牙周組織新生血管計數(shù)高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 實驗組與對照組新生血管計數(shù)的比較 (個，

注：P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

3 討論

加速正畸牙移動過程中的牙周組織改建才能加速正畸牙移動，研究牙周組織改建及牙移動的機理對正畸臨床有重要的實際意義。有研究顯示：實驗性牙移動與營養(yǎng)因素、藥物的使用等有關(guān)。如雌激素、雄激素可使實驗性牙移動減緩；而皮質(zhì)激素和甲狀腺激素將使實驗性牙移動加快。L-ARG也是一種可利用的營養(yǎng)素，因其對局部缺血組織的再生和血管發(fā)生的有益的作用，目前在臨床上已應(yīng)用于治療多種缺血性疾病，但有些方面仍在觀察研究之中。一氧化氮合酶的亞型有3種：內(nèi)皮型(endothelial nitric oxide synthase,eNOS) 、神經(jīng)元型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導(dǎo)型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[6]，NO是最重要的一種內(nèi)皮源性血管活性因子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng)，具有擴張血管、組織修復(fù)等作用，以L-Arg為底物，由NOS催化生成[7]。NO途徑也是一種重要的新血管形成的調(diào)節(jié)器。研究表明外源性L-Arg能增加血管NO生物活性，明顯促進(jìn)NO合成[8]。而受力反應(yīng)中NO的釋放主要由eNOS 催化產(chǎn)生。Nakago也發(fā)現(xiàn)NO增加出現(xiàn)在成纖維細(xì)胞受力后，且是eNOS促使NO增加，而不是iNOS。

本實驗結(jié)果顯示，在對照組和實驗組中eNOS都隨著時間呈一定的變化規(guī)律的表達(dá)。eNOS在血管上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均呈不同程度陽性表達(dá)。而且從第3天開始，eNOS表達(dá)實驗組高于對照組。說明對于實驗性牙移動的牙周組織改建這一過程eNOS參與其中，且L-Arg促進(jìn)eNOS參與。分析機制可能為細(xì)胞因子如IL-1、VEGF等早期產(chǎn)生較少，則早期主要是由正畸牽引力誘使eNOS表達(dá)升高，之后伴隨細(xì)胞因子增加，如VEGF是eNOS和NO的上游調(diào)節(jié)[9]，以及持續(xù)的牽引力進(jìn)一步升高eNOS的表達(dá)，兩組高峰均出現(xiàn)于第3天，之后因為產(chǎn)生的NO和活化的破骨細(xì)胞可能也反過來使eNOS的活性受到抑制，同時牽引力使牙齒向其方向移動，牽張力對牙周組織的刺激減小，部分細(xì)胞因子也開始減少，降低了eNOS的表達(dá)，eNOS在這個過程中將機械力轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘瘜W(xué)信號，起了介導(dǎo)的作用。注射L-Arg后，eNOS的表達(dá)明顯增多，說明促進(jìn)了eNOS在實驗性牙移動中的參與。

本實驗中實驗組和對照組血管的增殖和再生開始于加力1天，血管化反應(yīng)高峰出現(xiàn)于7天時，在此之后降低。在加力第3天-第7天時實驗組新生血管計數(shù)高于對照組，說明在局部缺血環(huán)境中，血管形成增加與eNOS的過表達(dá)有關(guān)。這與Corbett等認(rèn)為NOS 的表達(dá)可改善局部微循環(huán)，增加血流量的研究結(jié)果相似。而且eNOS影響血管形成和改建，其主要產(chǎn)生不分支的、大的血管[10]。

本實驗結(jié)果還顯示，實驗組和對照組中eNOS在牙根周圍牙槽骨表面破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中均有表達(dá)，提示eNOS參與早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建。NOS和NO與骨代謝密切相關(guān)聯(lián)[11]，Zaman等研究表明在機械負(fù)荷作用下，骨細(xì)胞主要表達(dá)eNOS，而iNOS及nNOS幾乎不表達(dá)。在兔下頜骨骨折愈合中也有類似情況，通過調(diào)控NOS的表達(dá)，調(diào)節(jié)了成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化能力，導(dǎo)致骨代謝發(fā)生改變[12]。而且實驗組中eNOS在破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中的表達(dá)較對照組明顯，破骨細(xì)胞活化也明顯，破骨活躍，成骨也被促進(jìn)。提示注射NO前體L-Arg促進(jìn)早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建并促進(jìn)eNOS參與這一過程。分析原因近年來發(fā)現(xiàn)NO是骨反應(yīng)的重要媒介和信號分子，其參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞活性[13]及維持骨形態(tài)和進(jìn)行骨改建，并在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的信號傳導(dǎo)進(jìn)程中起重要作用[14]。如eNOS所合成的低濃度的NO可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體成熟，成骨細(xì)胞增殖，骨基質(zhì)分泌功能增加，從而進(jìn)行骨改建[15,16]。因此藥物和條件的改變可以引起局部 NO 濃度的變化，從而引起骨的重塑[17]。

綜上，L-Arg通過上調(diào)實驗性牙移動牙周組織中eNOS的表達(dá)，促進(jìn)eNOS參與牙周組織改建，從而在促進(jìn)牙周組織的血管改建與骨改建方面發(fā)揮了作用。