SARA低表達對Activin A/Smads環(huán)路活性的影響

石曉花,王姣琦,劉洪雨,董 玥,紀秋野,崔 楊,何金婷,莽 靖,徐忠信

(1.吉林大學臨床醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

激活素A(ActA)是目前較公認的神經(jīng)保護因子[1,2]。研究表明ActA主要通過ActA/Smads線性跨膜信號轉(zhuǎn)導將胞外信號傳遞至胞內(nèi)[3-5]。近期研究發(fā)現(xiàn)ActA/Smads信號具有環(huán)路作用模式[6]。但該環(huán)路活性是否受其他因子調(diào)控尚不清楚。Smad錨捉蛋白(SARA)作為R-Smads的磷酸化輔助因子，其在經(jīng)典ActA/Smads線性通路中的功能已經(jīng)被證實[7]，但在ActA環(huán)路的調(diào)控作用尚不明確。本研究利用靶向大鼠SARA基因的shRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)SARA表達，Western blot通過對Smad3總蛋白及磷酸化蛋白水平進行檢測評估ActA環(huán)路活性，為進一步明確ActA/Smads環(huán)路調(diào)控機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料

PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤)由國家實驗細胞資源共享服務平臺提供。ActA高表達的PC12細胞由本課題組提供[8]。G418購自美國GIBCO公司。SARA及內(nèi)參GAPDH基因引物由上海生工公司合成。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invetrogen公司。Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒及Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。兔抗大鼠Smad3、磷酸化Smad3抗體購自美國ThermoFisher公司，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自美國Santa公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠、羊抗兔抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1PC12細胞及ActA高表達細胞的培養(yǎng) PC12細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%馬血清、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。每2-3天根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液顏色更換培養(yǎng)液，細胞接近80 %融合時用0.25 %的胰酶進行消化傳代。構(gòu)建靶向大鼠INHBA基因的重組真核表達載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PC12細胞后G418(終濃度300 μg/ml)篩選2個月，獲得ActA高表達的PC12細胞，隨后將G418的濃度降為150 μg/ml進行維持篩選。除加入G418外，ActA高表達PC12細胞的培養(yǎng)方法同前。

1.2.2shRNA質(zhì)粒的設計合成 從大鼠SARA基因(NM_001107952.1)編碼序列中選擇特異性靶序列，分別是第4324位 (shRNA1):5′-GATGACCACCGTACCTGCC-3′和第1081位 (shRNA2):5′-CAAATGGATGCTTTGAATAAA-3′。另設計2段同源的隨機對照序列作陰性對照。利用BLAST網(wǎng)站進行靶序列及陰性對照序列的同源性分析。委托武漢市淅瑪生物技術有限公司使用pGenesil-3質(zhì)粒構(gòu)建shRNA表達載體。DNA測序驗證成功后，將靶向SARA基因的質(zhì)粒命名為SARA-shRNA；對照質(zhì)粒命名為NC-shRNA。

1.2.3shRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及實驗分組 將ActA高表達的PC12細胞接種于6孔板，細胞70-80%融和時按照shRNA轉(zhuǎn)染說明書進行操作。轉(zhuǎn)染48 h后避光條件下，倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率并攝圖。以ActA高表達的PC12細胞作為正常對照，記為Control組；SARA-shRNA轉(zhuǎn)染的ActA高表達細胞作為陽性轉(zhuǎn)染組，記為SARA-shRNA組；NC-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ActA高表達細胞作為陰性對照，記為NC-shRNA組。

1.2.4實時定量PCR檢測SARA基因mRNA的表達 收集上述三組細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA?；驒z測引物如下：SARA F：5′-TACAGATCAGCCAACCTGAGGA-3′，R：5′-ATACA ATTGGGCTCTGCATTCC -3′，擴增長度192 bp；GAPDH F：5′-GGTTACCAGG GCTGCCTTCT-3′，R：5′-ATGGGTTTCCCGTTGATGAC-3′，擴增長度171 bp。按照實時定量PCR說明書步驟配置反應體系，設定PCR運行參數(shù)。PCR反應使用ABI7500Fast 型實時熒光定量PCR儀，熒光收集及分析利用ABI7500Fast 程序軟件。應用Relative Quantification (ddCt) Study進行相對表達量(relative quantity，RQ)RQ分析，計算SARA基因的相對表達水平。檢測實驗重復三次。

1.2.5Western blot檢測SARA及Smad3蛋白水平的表達 提取各組總蛋白，紫外分光光度計測定蛋白濃度并調(diào)整上樣量。每組蛋白100 ℃煮沸 5 min后上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋抗體，分別為兔抗大鼠SARA(1∶10000)，Smad3(1∶1000)，磷酸化Smad3(1∶1000)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1000)，一抗4 ℃ 過夜孵育。次日洗膜后二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，ECL顯影壓膠片。凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片，使用吸光度分析計算目的條帶與相應內(nèi)參條帶的灰度值，以兩者的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 shRNA瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)SARA基因表達

利用RNA干擾技術，構(gòu)建靶向SARA基因的shRNA質(zhì)粒。該質(zhì)粒因攜帶DsRed2序列而在554 nm的激發(fā)光下產(chǎn)生紅色熒光。瞬時轉(zhuǎn)染Act A高表達的PC12細胞。轉(zhuǎn)染48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖1-A-D，明暗場對比，SARA-shRNA及NC-shRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率均超過70 %。實時定量PCR及Western blot檢測SARA蛋白水平的表達，結(jié)果如圖1-E-F，靶向SARA基因的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)SARA轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表達。

2.2 SARA低表達下調(diào)Act A/Smads環(huán)路活性

SARA低表達下調(diào)Smad3總蛋白及磷酸化蛋白水平。如圖2,SARA-shRNA組，細胞換液3 h，ActA環(huán)路自發(fā)活化后，與NC-shRNA組比較，Smad3總蛋白及磷酸化蛋白分別下調(diào)44%和57%。

3 討論

激活素A作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)超家族的成員之一，是目前較公認的神經(jīng)保護因子，在包括缺血性腦血管病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性變在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護作用[1,2]。它是由兩個βA亞基通過二硫鍵連接成的二聚體結(jié)構(gòu)蛋白。β亞基是它的基本單位，由INHBA基因編碼。經(jīng)典研究認為，ActA作為細胞外配體，主要通過ActA/Smads線性跨膜信號轉(zhuǎn)導將胞外信號傳遞至胞內(nèi)，經(jīng)Smads級聯(lián)反應完成膜受體激活的Smads (R-Smads)，如Smad2、Smad3的磷酸化活化及核內(nèi)遷移，從而調(diào)控靶基因的表達，發(fā)揮相應的生物學功能[3-5]。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，ActA/Smads信號還具有環(huán)路作用模式[6]。利用ActA基因高表達的PC12細胞進行的研究發(fā)現(xiàn)，隨著外源INHBA基因的高表達，ActA合成增加并分泌到細胞外，其細胞外積累可觸發(fā)ActA信號短時活化，并反過來上調(diào)內(nèi)源性INHBA基因的表達，從而構(gòu)成ActA/Smads 正反饋環(huán)路[8]。利用該細胞模型，實現(xiàn)了在非病理情況下模擬損傷性刺激介導的INHBA基因表達上調(diào)及ActA信號活化的生物學過程，并去除了外界損傷對細胞狀態(tài)及基因表達的影響，更利于探討ActA信號環(huán)路及其相關因子的表達變化及生物學功能。因此，本研究延續(xù)課題組前期工作，繼續(xù)利用ActA高表達的PC12細胞探討可能影響ActA環(huán)路活性的調(diào)控因子。

圖1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)SARA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達

(A)NC-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h的明場圖；(B)NC-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h相應的暗場圖；(C)SARA-shRNA轉(zhuǎn)染48 h的明場圖；(D)SARA-shRNA轉(zhuǎn)染48 h相應的暗場圖。(標尺=50 μm)；(E)SARA轉(zhuǎn)錄水平的表達檢測；(F)SARA蛋白表達及灰度分析。(*與Control組及NC-shRNA組比較P<0.05，n≥3/組)

圖2 SARA低表達對Act A/Smads環(huán)路活性的影響

SARA作為R-Smads向膜受體募集的重要輔助因子，通過調(diào)控Smads與TGF-β受體的定位影響Smad2、Smad3的平衡和分布[9]。在缺血性腦損傷中，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SARA具有輔助R-Smads磷酸化活化，維持ActA/Smads線性通路活化的作用[7]。但在ActA信號環(huán)路中，SARA是否調(diào)控ActA環(huán)路活性尚不清楚。

本研究利用RNA干擾技術(RNAi)，構(gòu)建靶向SARA基因的shRNA表達載體。該載體由啟動子、發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列和終止子組成，編碼出具有類似miRNA前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)核糖核酸酶Drosha酶切成shRNA前體(pre-shRNA)，再在Exportin 5的作用下出核。出核后的pre-shRNA經(jīng)Dicer酶切后與RNA誘導的基因沉默復合物(RISA)結(jié)合，通過完全或不完全地與靶基因mRNA互補達到降解該基因 mRNA 或抑制 mRNA 翻譯蛋白質(zhì)的作用[10]。通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染shRNA載體，本研究成功下調(diào)了ActA高表達細胞內(nèi)SARA基因mRNA及蛋白水平的表達。與正常的PC12細胞不同，ActA高表達細胞隨著外源性INHBA基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，ActA表達升高并在細胞外積累，繼而觸發(fā)ActA信號活化，激活下游Smads級聯(lián)反應。前期研究發(fā)現(xiàn)ActA高表達的PC12細胞換液3 h時ActA環(huán)路活化，表現(xiàn)為Smad3總蛋白及磷酸化蛋白表達升高，Smad4的核內(nèi)熒光強度增強，內(nèi)源性INHBA 基因表達上調(diào)[8]。本研究細胞換液3 h時對Smad3總蛋白及磷酸化蛋白進行檢測后發(fā)現(xiàn)，SARA低表達組(SARA-shRNA組)Smad3總蛋白及磷酸化蛋白的水平較陰性轉(zhuǎn)染組(NC-shRNA組)明顯減低，說明SARA低表達降低了環(huán)路的活化水平，提示在ActA正反饋環(huán)路中SARA的表達水平仍是環(huán)路活性的一個調(diào)控因子。作為潛在干預位點，進一步探討SARA高表達對Act A/Smads環(huán)路活化時間及生物學功能的影響將為抗缺血性腦損傷位點的選擇提供新思路。