卵巢癌患者血游離DNA的臨床研究

劉俊寶，曹 璐，秦 瑞，沈美娜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130033)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，致病因素中遺傳和環(huán)境因素逐漸受到重視。大多數(shù)外源性致癌物進(jìn)入人體之后經(jīng)過兩個(gè)階段代謝[1]，(1)經(jīng)Ⅰ相代謝酶啟動(dòng)致癌過程；其典型代表是CYP450家族中的CYP1A1基因，而該基因中的MSPI多態(tài)性成為了主要的研究對(duì)象。(2)由Ⅱ相代謝酶發(fā)生解毒反應(yīng)。比較有代表性的物質(zhì)當(dāng)屬谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)中的GSTT1。因此，人體對(duì)腫瘤的易感性有可能與人體發(fā)生解毒代謝作用失衡和Ⅰ、Ⅱ相代謝酶將致癌物加以激活存在一定的關(guān)系。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)只在各種腫瘤組織中表達(dá)，使其成為腫瘤分子生物學(xué)中繼抑癌基因和癌基因的研究后新出現(xiàn)的又一研究熱點(diǎn)。本研究主要是從91例卵巢癌患者靜脈血中提取DNA，然后進(jìn)行CYP1A1MSPI多態(tài)性、GSTT1多態(tài)性及MSI的檢測，為卵巢癌的早期診斷、評(píng)估以及預(yù)后提供一定的理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1標(biāo)本 卵巢癌組：研究以回顧性分析法從2005年到2007年期間吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦科所收治的，并經(jīng)手術(shù)術(shù)后病理確診為卵巢癌的患者中優(yōu)選91例作為研究對(duì)象。對(duì)照組：在相同時(shí)期內(nèi)所收治的15例沒有出現(xiàn)遺傳性病變的卵巢良性腫瘤患者。卵巢癌組中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期的患者人數(shù)依次為23例(25.27%)、11例(12.09%)和57例(62.64%)。卵巢癌組臨床病理類型：卵巢上皮性惡性腫瘤(共70例，占76.92%)，其中漿液性囊腺癌46例、黏液性囊腺癌12例、子宮內(nèi)膜樣癌10例、庫肯勃瘤2例；卵巢非上皮性惡性腫瘤(共21例，占23.08%)其中生殖細(xì)胞惡性腫瘤10例，包括無性細(xì)胞瘤3例、惡性畸胎瘤2例、內(nèi)胚竇瘤5例；性索間質(zhì)惡性腫瘤6例(全部為顆粒細(xì)胞瘤)；卵巢轉(zhuǎn)移癌5例。

1.1.2試劑 taq酶、 dNTP、 EB、聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。DL-2000 DNA MARKER購自大連TAKARA 公司。

1.2 方法

首先對(duì)三組患者進(jìn)行血液標(biāo)本的采集。采用回顧性分析法分析目標(biāo)組患者的一般資料，然后采用常規(guī)酚-氯仿抽提基因組DNA，并進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，借助PCR-RFLP和PAGE-SSCP對(duì)該組患者血液標(biāo)本中GSTT1基因多態(tài)性、CYP1A1基因MSPI多態(tài)性和MSI進(jìn)行分析并判斷其與卵巢癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。然后對(duì)其行測序驗(yàn)證處理，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行對(duì)比分析，分析三者與卵巢癌患者臨床病理分期和病理類型等之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后選用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中計(jì)數(shù)資料和臨床資料依次選用比值比和描述性分析(包括構(gòu)成比、中位數(shù)和率的分析)。另外對(duì)計(jì)數(shù)資料行卡方檢驗(yàn)，旨在對(duì)比基因型在對(duì)照組和卵巢癌組中存在的差異。

2 結(jié)果

2.1 MSI在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.1.14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 見圖1-4，從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)其PCR擴(kuò)增結(jié)果均為單一條帶，且有著和引物設(shè)計(jì)的目的產(chǎn)物片段相同的長度。

圖1 D5S346位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 D7S486位點(diǎn)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 D11S904位點(diǎn)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖4 D7S522 的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.1.2PCR產(chǎn)物后的聚丙烯凝膠電泳 通過對(duì)比機(jī)體外周靜脈血DNA的擴(kuò)增后行PAGE的條帶發(fā)現(xiàn)當(dāng)癌組織DNA的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因出現(xiàn)減少或增多的時(shí)候，此時(shí)可以認(rèn)定為MSI。除此之外，研究還針對(duì)全部的存在可疑病例和陽性病例給予二次PCR和電泳確定。本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者中，對(duì)其行PCR沒有發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)了條帶的遷移、缺失和增多等癥狀。通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE分析發(fā)現(xiàn)樣品有一部分發(fā)生條帶增多，其中多出電泳帶的樣本就是發(fā)生MSI的樣本，結(jié)果見圖5-6。

圖5 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖6 上述PCR產(chǎn)物的相對(duì)應(yīng)的聚丙烯凝膠電泳圖譜

2.1.3測序結(jié)果 對(duì)本研究中PAGE出現(xiàn)的多余條帶和PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳一條帶實(shí)施測序分析。對(duì)疑有突變樣本的基因和各微衛(wèi)星位點(diǎn)的測序結(jié)果實(shí)施網(wǎng)絡(luò)比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其存在五處點(diǎn)突變，具體為：第5位和12位核苷酸發(fā)生C缺失；第164位和181位的C依次突變成為了A和G；而第185位上的核苷酸A則突變成了G。通過對(duì)全部疑似突變的樣本實(shí)施測序比對(duì)分析。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與卵巢癌之間的關(guān)系見表1、表2。

表1 卵巢癌不同類型和MSI之間的關(guān)聯(lián)

表2 卵巢腫瘤和MSI發(fā)生率之間的關(guān)聯(lián)

2.2 CYP1A1基因MSPI多態(tài)性在卵巢癌中的表達(dá)情況及與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1CYP1A1基因MSPI多態(tài)性的檢測結(jié)果 CYP1A1基因的MSPI多態(tài)性具有A、B、C三種基因型，分別為野生型T/T；雜合型T/C； 突變純合型C/C。給予所有卵巢癌患者實(shí)施CYP1A1基因MSPI多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)A、B和C基因型依次為50例(55%)、28例(31%)和13例(14%)。

2.2.2CYP1A1基因MSPI多態(tài)性與卵巢癌病理類型之間的關(guān)系 該基因A基因型組卵巢上皮性癌42例，卵巢非上皮性惡性腫瘤8例；B基因型組與C基因型組卵巢上皮性癌及卵巢非上皮性惡性腫瘤分別為17例及11例、11例及2例。對(duì)各個(gè)基因型組比對(duì)其卵巢非上皮性惡性腫瘤和上皮性惡性腫瘤發(fā)現(xiàn)，就病理類型構(gòu)成比而言具備差異顯著性。

2.3 GSTT1基因多態(tài)性在卵巢癌中的表達(dá)情況及與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3.1PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 結(jié)果顯示GSTT1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為450 bp，而GAPDH基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度則為746 bp。給予所有擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳后根據(jù)其出現(xiàn)條帶的數(shù)據(jù)可以判斷為何種基因。例如當(dāng)出現(xiàn)兩條帶時(shí)(450 bp和746 bp)可以判斷其為GSTT1功能型(+/+)基因型，反之出現(xiàn)一條帶時(shí)(746 bp)，則被認(rèn)為是GSTT1缺失型(null)基因型。其PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖7所示。

圖7 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

在上圖7中的電泳譜圖中出現(xiàn)五條電泳道，其中第一條、二條、三條、四條和五條電泳道依次表示為DNA分子量的標(biāo)記帶、卵巢癌組樣本、卵巢癌組樣本、對(duì)照組樣本和對(duì)照組樣本。其中第一條譜帶從下到上依次是100、250、500、1000和2 000 bp。第二條只有一條譜帶(746bp)，第三條有兩條譜帶，從下到上依次是450和746 bp。通過譜帶可以確認(rèn)其為GSTT1功能型基因型。

就GSTT1缺失型基因型分布頻率來說，對(duì)照組和卵巢癌組依次是14%(7/50)和35.1%(32/91)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)兩組相比較有顯著性差異(χ2=6.205，P<0.05)。所以考慮GSTT1基因缺失可能增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.2GSTT1基因多態(tài)性與卵巢癌臨床分期的關(guān)系 患者早期(Ⅰ-Ⅱ期)和晚期(Ⅲ-Ⅳ期)GSTT1缺失型基因型頻率分布分別為41%和32%，通過兩組數(shù)據(jù)的卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示其并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)如下表3所示。

表3 GSTT1基因缺失與卵巢癌分期的關(guān)系

2.3.3GSTT1基因多態(tài)性與卵巢癌病理類型的關(guān)系 GSTT1缺失型(null)基因型在卵巢上皮性惡性腫瘤和卵巢非上皮性惡性腫瘤中分布頻率分別為43%(30/70)、14%(3/21)。GSTT1基因缺失在卵巢上皮性惡性腫瘤與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)其具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)卵巢非上皮性惡性腫瘤而言與對(duì)照組相比其并不存在顯著性差異。具體如下表4所示。

表4 GSTT1基因缺失與卵巢癌病理類型的關(guān)系

3 討論

卵巢癌是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，70%以上的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)己屬于晚期。而卵巢癌患者的外周血液中游離循環(huán)DNA會(huì)出現(xiàn)顯著性提升，我們通過對(duì)血漿/血清DNA進(jìn)行定性分析，針對(duì)其存在的腫瘤基因進(jìn)行特異化檢驗(yàn)，以期待探索一種新的可用于卵巢癌早期診斷和療效監(jiān)控的方法。

CYP1A1是細(xì)胞色素P450(Cyto-chrome P450,CYP)家族的一名成員,是活化二惡英等環(huán)境毒素的主要酶類[2]，它能夠?qū)⒁恍┒舅睾椭掳┪镔|(zhì)活化成為有很強(qiáng)親電性的終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，之后通過和細(xì)胞內(nèi)RNA、DNA以及蛋白質(zhì)親核基團(tuán)等物質(zhì)相互發(fā)生作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，酶失活或出現(xiàn)功能障礙，繼而導(dǎo)致體內(nèi)某些基因表達(dá)異?；蛑苯影l(fā)生基因突變，促使細(xì)胞受到損傷，表現(xiàn)出發(fā)生腫瘤或程序性衰亡癥狀[3]。截止到目前為止，通過對(duì)CYP1A1基因的研究顯示在其上面存在4個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性(如CYP1A1基因MSPI多態(tài)性等)。本研究也發(fā)現(xiàn)，卵巢惡性腫瘤的患者中確實(shí)存在CYP1A1基因MSPI多態(tài)性，所以考慮CYP1A1基因多態(tài)性可以從惡性腫瘤患者的循環(huán)DNA中進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)卵巢癌組行GSTT1多態(tài)性檢測顯示，該基因的缺失促使患者患上卵巢癌的概率發(fā)生上升，因此可以認(rèn)為GSTT1基因有可能是卵巢上皮性癌的易感基因。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定的發(fā)生目前認(rèn)為主要是錯(cuò)配修復(fù)基因的改變，正因?yàn)檫@一改變，才使得復(fù)制錯(cuò)誤、錯(cuò)配堿基得不到正常的校正和修復(fù)，進(jìn)而促使微衛(wèi)星DNA發(fā)生變化，最終影響該DNA的正常調(diào)控，同時(shí)基因的穩(wěn)定性也跟著發(fā)生變化，進(jìn)而提升基因突變的概率，促發(fā)了惡性腫瘤的形成。本次研究結(jié)果表明，微衛(wèi)星不穩(wěn)定除了與患者的病理類型存在一定的關(guān)聯(lián)以外還影響卵巢癌的分期。因此，我們認(rèn)為，MSI很可能是腫瘤發(fā)生進(jìn)展的一種體現(xiàn)。

采用特異性高的以PCR為基礎(chǔ)的血液分析，檢查兩個(gè)基因標(biāo)記物和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，會(huì)提高試驗(yàn)的特異性和敏感性，有助于腫瘤的診斷。在其早期，通過動(dòng)態(tài)性監(jiān)測給予腫瘤患者治療方案的確定提供一定的理論支撐，同時(shí)這種檢查也會(huì)更容易被患者所接受。但是目前，受制于血液循環(huán)DNA量的改變，對(duì)腫瘤進(jìn)行定性和定量診斷還有相當(dāng)?shù)碾y度。與此同時(shí)，因?yàn)槟[瘤組織的異質(zhì)性等原因，有部分檢測結(jié)果會(huì)表現(xiàn)出假陽性或假陰性，這樣就對(duì)腫瘤的早期診斷產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。當(dāng)前針對(duì)在臨床上應(yīng)用循環(huán)血DNA檢測還有待進(jìn)一步的研究[4]。但依照其發(fā)展前景來看，其勢必會(huì)成為臨床研究的一大熱點(diǎn)。