568例HER2不確定乳腺癌原位雜交結(jié)果分析

蔣依娜，王博，周燦，王鴻雁

0 引言

編碼HER2蛋白的人類表皮生長因子受體2（Human epidermal growth factor receptor, HER2）基因位于17號染色體。HER2基因擴(kuò)增與腫瘤的侵襲性增強和預(yù)后不良相關(guān)，約15%～20%的乳腺癌患者存在HER2基因擴(kuò)增[1]。曲妥珠單抗（Herceptin，赫賽?。┦轻槍ER2基因擴(kuò)增患者的單克隆抗體，作為一線藥物，與紫杉類藥物聯(lián)合應(yīng)用能延長轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存期，提高患者生存質(zhì)量，單藥應(yīng)用也能起到治療作用[2-3]。新藥如拉帕替尼、帕妥珠單抗[4]等也逐漸被用于臨床。準(zhǔn)確判定HER2基因狀態(tài)是患者篩選和療效預(yù)測的前提。

對于免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）為2+的HER2不確定病例，ASCO/CAP乳腺癌HER2檢測指南推薦使用原位雜交（in situ hybridization, ISH）法進(jìn)一步檢測HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)。熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization, FISH）檢測結(jié)果準(zhǔn)確，在臨床應(yīng)用最為廣泛。雙色銀增強原位雜交（dual-color silver enhanced in-situ hybridization, DISH）因其亮視野的優(yōu)勢也逐漸應(yīng)用于HER2基因狀態(tài)評估。對于ISH結(jié)果判定，2018版[5]HER2檢測指南與2013版[1]相比，取消了HER2“不確定”的診斷名稱，將雙探針I(yè)SH的HER2檢測結(jié)果分為5組，且更強調(diào)HER2/CEPl7的重要，旨在進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，指導(dǎo)臨床用藥。本研究分別采用2013版及2018版ASCO/CAP指南標(biāo)準(zhǔn)，對568例免疫組織化學(xué)HER2不確定浸潤性乳腺癌組織的FISH結(jié)果進(jìn)行對比分析，并隨機抽取60例進(jìn)行DISH檢測，比較FISH及DISH檢測結(jié)果差異。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本處理

收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2013—2017年手術(shù)切除診斷為浸潤性乳腺癌的標(biāo)本568例。標(biāo)本采用4%中性甲醛固定液切開固定6～24 h，標(biāo)準(zhǔn)化取材，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 IHC檢測

采用HER2（4B5，兔單克隆抗體，Ventana公司，瑞士）抗體、ultra View Universal DAB（Ventana公司，瑞士）檢測試劑盒及Ventana BenchMark XT（羅氏公司，瑞士）全自動切片染色機。所有病例均設(shè)有陽性對照，由2位病理醫(yī)生判讀，結(jié)果均為2+。

1.3 FISH檢測

所有病例均進(jìn)行HER2雙探針FISH檢測，并按2013版及2018版ASCO/CAP乳腺癌HER2檢測指南標(biāo)準(zhǔn)分別判讀。所用PathVysion HER2 DNA、第17號染色體著絲粒（CEP17）雙熒光探針試劑盒、蛋白酶緩沖液、橡膠水泥等均購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。石蠟切片56℃烤片過夜、常規(guī)脫蠟、蛋白酶消化、乙醇脫水，取10 μl探針混合液加蓋玻片、橡膠水泥封片，75℃變性10 min后在雜交儀（美國Abbott StatSpin ThermoBrite公司）內(nèi)37℃雜交過夜（15～17 h）。次日洗片后二脒基苯基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，VideoTest軟件進(jìn)行圖像合成。

1.4 DISH檢測

隨機抽取60例進(jìn)行DISH檢測并評估HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)。全過程包括脫蠟、修復(fù)、酶消化、探針雜交、顯色等，均在BenchMark XT全自動切片染色機內(nèi)進(jìn)行。采用試劑購自羅氏公司，包括HER2/CEP17號染色體DNA雙探針、清洗緩沖液、銀染原位雜交DNP染色液及原位雜交地高辛紅染染色液及銀染清洗緩沖液。操作步驟及參數(shù)設(shè)置按照操作手冊及試劑說明書。常規(guī)封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 判讀標(biāo)準(zhǔn)

分別采用2013版及2018版ASCO/CAP乳腺癌HER2原位雜交判讀標(biāo)準(zhǔn)， FISH與DISH檢測判讀標(biāo)準(zhǔn)相同，判讀至少2個浸潤性癌區(qū)域，隨機選擇20個腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核大小一致且邊界完整、無重疊、信號清楚。結(jié)果不一致的病例，由第三位高年資病理醫(yī)生參與共同閱片，確定最終結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對于不同標(biāo)準(zhǔn)下的檢測結(jié)果行配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。FISH與DISH兩種檢測結(jié)果的相關(guān)性，通過Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 FISH檢測結(jié)果

568例浸潤性乳腺癌均為IHC檢測不確定標(biāo)本，男6例，女562例，平均年齡51.3歲（24～85歲），依據(jù)2013版ASCO/CAP指南分為：HER2陽性183例（183/568, 32.22%）、陰性365例（365/568, 64.26%）、不確定20例（20/568,3.52%）；在陽性病例中，HER2/CEP17≥2.0者170例（170/183, 92.90%），HER2/CEP17＜2.0者13例（13/183, 7.10%）。 依據(jù)2018版 ASCO/CAP HER2檢測指南分為：HER2陽性157例（157/568,27.64%）、陰性365例（365/568, 64.26%）、需進(jìn)一步檢測HER2狀態(tài)46例（46/568, 8.10%），其中第二、三組均為13例（2.29%），第四組20例（3.52%），見表1。

2.2 新舊版HER2指南變化

表1 568例免疫組織化學(xué)不確定的浸潤性乳腺癌HER2 FISH檢測結(jié)果Table1 FISH results of HER2 in 568 cases of immunohistochemical HER2 equivocal invasive breast cancer

采用2018版標(biāo)準(zhǔn)后，在未進(jìn)行進(jìn)一步IHC或ISH 計數(shù)的前提下，HER2陽性率減少了4.58%，陰性率無差異，需進(jìn)一步檢測HER2基因狀態(tài)的病例增加了4.58%，兩種診斷標(biāo)準(zhǔn)相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）。

2.3 FISH和DISH檢測結(jié)果比較

在FISH檢測的568例浸潤性乳腺癌患者中，隨機抽取60例進(jìn)行DISH檢測，兩種檢測方法比較結(jié)果，見表2。

表2 FISH和DISH方法檢測HER2基因狀態(tài)的比較Table2 Comparison of HER2 gene status between FISH and DISH test

按2013版ASCO/CAP檢測指南對60例浸潤性乳腺癌HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的FISH和DISH檢測結(jié)果比較顯示，兩者總符合率為95.0%（57/60），其中19例FISH陽性病例中DISH陽性18例（圖1）、DISH為不確定1例，陽性符合率為94.7%；3例FISH不確定病例（圖2A、3A），DISH不確定1例（圖2B）、陰性2例（圖3B），符合比例為33.3%；38例FISH陰性病例中DISH均為陰性，陰性符合率為100.0%。

FISH方法檢測結(jié)果中HER2/CEP17比值范圍為0.9～10.0，中位數(shù)為1.4，DISH方法檢測結(jié)果中HER2/CEP17比值范圍為0.7～12.5，中位數(shù)為2.4，通過Pearson相關(guān)性分析，兩種方法的檢測結(jié)果顯著相關(guān)（r=0.636, P＜0.01）。

圖2 HER2基因擴(kuò)增不確定的浸潤性乳腺癌Figure2 HER2 equivocal invasive breast cancer specimen tested by FISH and DISH

圖3 FISH與DISH檢測結(jié)果不一致病例Figure3 Inconsistent case tested by FISH and DISH

3 討論

1987年Slamon第一次提出HER2基因在乳腺癌生物學(xué)行為和腫瘤發(fā)生方面具有重要的意義[6]。2000年，針對HER2基因擴(kuò)增的單克隆抗體曲妥珠單抗在歐洲注冊并用于治療HER2陽性乳腺癌患者，據(jù)報道該小分子抑制劑可減少50%復(fù)發(fā)率及約30%的死亡率[7-8]。目前，已有四種HER2靶向藥物被批準(zhǔn)用于臨床，曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗及ado-曲妥珠單抗emtansine[9]。HER2基因狀態(tài)的準(zhǔn)確評估，對于HER2基因擴(kuò)增乳腺癌患者的篩選、臨床用藥選擇及患者預(yù)后至關(guān)重要。

2007年ASCO/CAP首次推薦乳腺癌HER2檢測指南[10]作為臨床及病理醫(yī)生判讀評估乳腺癌患者HER2基因狀態(tài)的依據(jù)，旨在減少假陽性病例診斷，避免HER2靶向治療藥物過度使用而產(chǎn)生的不良反應(yīng)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。該指南于2013年更新[1]。2018年7月，根據(jù)文獻(xiàn)回顧及真實世界研究數(shù)據(jù)分析，ASCO/CAP發(fā)表了最新版HER2檢測指南[5]，與前幾版相比，該指南判讀標(biāo)準(zhǔn)更明確、分類更精細(xì)。變動主要包括以下幾方面：第一，將HER2 IHC 2+的定義由弱至中等強度的不完整細(xì)胞膜著色，更改為完整細(xì)胞膜著色。從而減少了IHC不確定病例的數(shù)量；第二，對于初診為HER2陰性的穿刺標(biāo)本，不再強調(diào)術(shù)后必須重復(fù)進(jìn)行HER2狀態(tài)檢測。認(rèn)為穿刺與手術(shù)切除標(biāo)本具有較高的一致性；第三，取消了HER2“不確定”的診斷名稱，將雙探針I(yè)SH的HER2檢測結(jié)果分為5組，對于爭議比較大的2、3、4組，建議聯(lián)合IHC和ISH的檢測結(jié)果綜合判讀。本研究同時進(jìn)行IHC、FISH和DISH的60例樣本中，3例為FISH不確定，屬于第4組，即HER2/CEP17＜2.0，HER2平均拷貝數(shù)≥4且＜6，根據(jù)2018版指南要求，重新進(jìn)行IHC結(jié)果為2+，隨后進(jìn)行第二種原位雜交方法DISH檢測，陰性2例，不確定1例，該不確定病例按照2013版指南應(yīng)診斷為HER2不確定，但是根據(jù)2018版指南，則應(yīng)診斷為HER2陰性。我們認(rèn)為，和前幾版相比，2018版指南減少了病理醫(yī)生診斷方面的困惑，特別是取消了“HER2不確定”的診斷名稱，對臨床用藥更具指導(dǎo)作用。

許多學(xué)者認(rèn)為，相對于HER2/CEP17比值而言， HER2基因拷貝數(shù)目更為重要。Varga等[11]研究發(fā)現(xiàn)， HER2基因擴(kuò)增常常伴隨著絲粒區(qū)的擴(kuò)增， 如果不強調(diào)HER2基因拷貝數(shù)，會導(dǎo)致HER2/CEPl7＜2.0的假陰性結(jié)果。另一方面，對于HER2/CEP17≥2.0且HER2拷貝數(shù)＜4的病例，根據(jù)2013版指南，應(yīng)判讀為HER2基因擴(kuò)增，但實際是否存在擴(kuò)增，專家之間意見尚未統(tǒng)一，有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)是CEP17拷貝數(shù)過低造成的假陽性結(jié)果。這部分陽性病例需更進(jìn)一步的隨訪。本研究中13例（2.29%）可歸為此類，目前相關(guān)的用藥療效統(tǒng)計仍在進(jìn)行中。

目前，臨床主要使用IHC法檢測HER2蛋白的表達(dá)水平，采用ISH法檢測HER2基因的擴(kuò)增水平。我國乳腺癌HER2檢測指南推薦以上兩種方法相結(jié)合的檢測策略[12]。在建立完善的實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序及使用標(biāo)準(zhǔn)化檢測試劑等前提下，IHC以其費用低、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于臨床。雖然，IHC僅能檢測HER2蛋白表達(dá)水平，但是仍可以準(zhǔn)確評估HER2狀態(tài)。Hanna等研究發(fā)現(xiàn)，對于手術(shù)切除標(biāo)本情況為0～1+的病例，與ISH相比，IHC僅存在0.84%的假陰性誤差[13]。雙探針FISH自1998年獲得FDA批準(zhǔn)以來，因其準(zhǔn)確客觀的優(yōu)點，一直作為檢測HER2基因狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用[14]。但FISH需全程避光并且需要配備熒光顯微鏡觀察信號，熒光易淬滅、切片不易長期保存。2008年，顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization, CISH）經(jīng) FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。作為亮視野下的原位雜交，該項技術(shù)由Tanner等首先引入乳腺癌HER2檢測[15]。但CISH不含17號染色體著絲粒探針，所以不能準(zhǔn)確判斷17號染色體多體的狀態(tài)，對HER2多倍體的病例判讀時會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。DISH技術(shù)是一種能夠同時檢測到HER2基因和17號染色體著絲粒的亮視野原位雜交技術(shù)，可實現(xiàn)全自動操作，耗時短，無需避光，普通光學(xué)顯微鏡可觀察結(jié)果，信號清晰，切片可長期保存，于2012年通過FDA認(rèn)證[16]，2014年獲得我國乳腺癌HER2檢測指南推薦應(yīng)用臨床[14]。對照研究發(fā)現(xiàn)，DISH技術(shù)與FISH和CISH符合率為94%～99%[17]。更有研究發(fā)現(xiàn)，在使用原位雜交技術(shù)檢測浸潤性乳腺癌中TOP2A基因狀態(tài)時，DISH較FISH更具優(yōu)勢[18]。Lim等的對比研究證明DISH與FISH相比，檢測符合率高，且用時短[16]。根據(jù)實驗室2年統(tǒng)計，DISH耗時僅為FISH檢測的1/2～1/3。

我們隨機抽取60例患者進(jìn)行DISH檢測，與FISH檢測的總體符合率為95.0%，其中陽性符合率為94.7% ，陰性符合率為100% 。DISH與FISH檢測結(jié)果的不一致性主要表現(xiàn)為陽性病例的減少和不確定病例的增加。判讀有差別的病例分析原因，主要有以下兩點：（1）DISH判讀標(biāo)準(zhǔn)中，黑色重疊信號計數(shù)為 1 個，低拷貝或CEP17多體時，易判讀為陰性結(jié)果；（2）計數(shù)區(qū)域選擇不同，乳腺癌異質(zhì)性較高，人為選擇計數(shù)區(qū)域會有差異，造成可能的判讀結(jié)果不同。所以，進(jìn)行DISH檢測時，應(yīng)根據(jù)各實驗室的實際條件，選擇最佳條件，減少誤差。并加強人員標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，選擇合適的區(qū)域進(jìn)行計數(shù)，在判讀黑色重疊信號時，應(yīng)用最科學(xué)準(zhǔn)確的方法。

綜上所述， 2018版指南取消“HER2不確定”診斷名稱，判讀標(biāo)準(zhǔn)更明確，對于準(zhǔn)確判讀HER2基因狀態(tài)、臨床用藥等方面更具指導(dǎo)作用。HER2基因的染色體多體性在乳腺癌中少見，因此判讀結(jié)果時HER2/CEP17比值與CEP17拷貝數(shù)同樣重要。但是，對于HER2/CEP17比值≥2.0，CEP17拷貝數(shù)＜4的病例實際是否存在HER2基因擴(kuò)增還需深入研究。在臨床應(yīng)用中，檢測浸潤性乳腺癌患者HER2狀態(tài)，IHC、FISH和DISH三種方法相輔相成，各具優(yōu)缺點。雖然DISH技術(shù)具有FISH和CISH缺乏的顯著優(yōu)點，并且檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但陽性率仍有待提高，應(yīng)結(jié)合各實驗室實際情況，優(yōu)化實驗條件，確保檢測準(zhǔn)確性。