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    不同成熟期桃品種NAC基因遺傳多樣性研究

    2018-01-06 00:31雷雨張雪芳羅鑫磊劉咲頔熊怡馮濤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期
    關(guān)鍵詞:成熟期

    雷雨+張雪芳+羅鑫磊+劉咲頔+熊怡+馮濤

    摘要: 從11個(gè)桃品種嫩葉中分別提取基因組DNA,根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫(kù)中NAC基因序列信息,設(shè)計(jì)特異引物,PCR擴(kuò)增,對(duì)產(chǎn)物克隆測(cè)序。然后,使用DNAman軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì),使用ORF Finder獲得開(kāi)放閱讀框和推導(dǎo)氨基酸序列,使用CDD工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析,利用Blastp工具搜索同源蛋白,采用Mega軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NAC蛋白第16~140位存在1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域,N端比較保守,C端則多樣性比較高;核苷酸變異有SNP和Indel 2類,津柳早紅和小白桃在第3外顯子區(qū)SNP和Indel變異數(shù)量非常多,說(shuō)明這2個(gè)品種的NAC基因結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。蛋白比對(duì)發(fā)現(xiàn),桃NAC與梅同源性最高,其次是鴨梨;進(jìn)化樹(shù)體現(xiàn)了物種的親緣關(guān)系。結(jié)果表明,參試品種NAC基因存在比較豐富的遺傳多樣性,在保守區(qū)內(nèi)的氨基酸變異可能影響蛋白的功能。

    關(guān)鍵詞: 桃;NAC轉(zhuǎn)錄因子;成熟期;保守區(qū);系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

    中圖分類號(hào): S662.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2017)22-0046-04

    NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,1996年Souer等首先從矮牽牛中克隆得到[1],隨后在擬南芥、水稻、小麥、大豆等中相繼發(fā)現(xiàn)。研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、激素調(diào)節(jié)以及對(duì)生物和非生物逆境的抗性等方面發(fā)揮作用[2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域,由約150個(gè)氨基酸殘基組成;C末端通常有簡(jiǎn)單的重復(fù)氨基酸序列,富含絲氨酸,蘇氨酸、脯氨酸和谷氨酸,或者酸性氨基酸殘基,具有轉(zhuǎn)錄激活功能。

    有研究者指出NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物生殖器官成熟和衰老。2006年,Uauy等從小麥中分離了NAM-B 1,功能分析顯示,它在野生小麥中加速植株衰老,促進(jìn)葉片中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向籽粒流動(dòng)[3]。2011年,Balazadeh等從擬南芥中分離了ORS1,超表達(dá)ORS1轉(zhuǎn)化擬南芥,加速了轉(zhuǎn)化體衰老[4]。2013年,Zhou等從水稻中鑒定出OsNAP,發(fā)現(xiàn)它調(diào)控葉片衰老[5]。2014年,Kim等在擬南芥上發(fā)現(xiàn)NAC有調(diào)控衰老的功能[6]。2013年,Pirona等利用桃Contender×Ambra和NJWeeping×Bounty F2代分離群體、SNP檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、對(duì)候選基因的Sanger測(cè)序等技術(shù),結(jié)合檢測(cè)等位基因在子代中的分離比例等,認(rèn)為NAC基因在控制桃果實(shí)成熟期中發(fā)揮重要作用[7]。筆者前期克隆了小白桃和它的早熟芽變品種津柳早紅的NAC基因,發(fā)現(xiàn)二者核酸序列有多處差異,尤其是后者中核苷酸變異形成終止密碼子,導(dǎo)致翻譯提前終止(未發(fā)表資料)。那么,在其他不同成熟期的桃品種中,NAC基因結(jié)構(gòu)是否存在多樣性?為了解答這個(gè)問(wèn)題,筆者從11桃品種中克隆了NAC基因,希望通過(guò)分析其結(jié)構(gòu),能找到一些NAC發(fā)揮功能的線索。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    2014年6月從天津?qū)W香果蔬有限公司(位于天津市西青區(qū)楊柳青鎮(zhèn)大柳灘村)桃資源圃采集津柳早紅、萬(wàn)壽紅等11個(gè)桃品種(表1)的嫩葉,液氮速凍,帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 基因組DNA提取

    采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的復(fù)雜植物基因組DNA提取試劑盒基因組DNA。使用Nanodrop 2000檢測(cè)核酸純度和濃度。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸完整性、潔凈度和有無(wú)其他類型核酸污染。保留純度和濃度符合要求的樣品,分別于-20 ℃保存。

    1.3 NAC基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    從GDR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rosaceae.org)獲取桃NAC基因序列信息,對(duì)5′UTR、外顯子區(qū)和3′UTR,用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異引物,委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL,dNTP Mixture 1.5 μL(2.5 mmol/L),模板cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL(20 μmol/L),Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(5 U/μL),其余用PCR級(jí)純水補(bǔ)充。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s,59 ℃退火45 s,72 ℃延伸 2 min);最后72 ℃延伸8 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,目的條帶回收、純化(Takara膠回收試劑盒),連接至pMD18-T載體,熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取陽(yáng)性單克隆、搖菌,選取陽(yáng)性克隆,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

    1.4 核酸序列比對(duì)和生物信息學(xué)分析

    使用DNAman 5.2軟件進(jìn)行核酸序列比對(duì),結(jié)合參考基因組中NAC基因序列,區(qū)別各品種NAC基因的外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū);使用ORF Finder在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)獲得開(kāi)放閱讀框和推導(dǎo)氨基酸序列;使用NCBI中的CDD工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。

    1.5 NAC同源蛋白及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

    利用NCBI中的Blastp工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索同源蛋白序列;使用DNAman進(jìn)行序列比對(duì);使用Mega 4.1軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NAC基因的克隆及測(cè)序

    根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫(kù)中桃NAC基因(ppa008301m)mRNA序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì):Forward primer為ATCCCTCTCTTTCTTTC TCTC,Reverse primer為ACCCCTACTCGATTTCTCCAC。以各品種基因組DNA為模板,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)得到約 1 400 bp 片段(圖1、圖2)。將上述產(chǎn)物克隆測(cè)序,分別獲得各品種NAC基因的核苷酸序列。

    2.2 NAC基因的結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性

    將NAC基因的DNA和cDNA序列進(jìn)行比對(duì),分析ORF和保守區(qū)。結(jié)果顯示,各品種的NAC基因編碼氨基酸157~385個(gè),在氨基酸序列第16~140位存在1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域,確認(rèn)了NAC基因身份。DNA和cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),它由5′UTR區(qū)、3個(gè)外顯子區(qū)、2個(gè)內(nèi)含子區(qū)和3′UTR區(qū)組成;在各區(qū)域均存在一定數(shù)量的變異(表2):變異分為SNP和Indel 2類;第1外顯子區(qū)有1處SNP,但它為同義突變,沒(méi)有引起氨基酸序列變化;第2外顯子區(qū)存在3處SNP,其中津柳早紅品種(代號(hào)11)的第470位核苷酸為C,其他10個(gè)品種均為A,該SNP使氨基酸126位的賴氨酸變?yōu)榫彼幔↘→R)(圖3-B),其余2處未引起氨基酸序列變化。第3外顯子區(qū)變異最多(圖3-A),非同義突變數(shù)量也最多,其中品種8在1 052~1 150位有一段99 bp的插入序列,引起插入33個(gè)氨基酸殘基;津柳早紅在559~560位有TT缺失,造成移碼突變,另外在569位有SNP,由T變G,出現(xiàn)終止密碼子,導(dǎo)致翻譯終止(圖3-C)。津柳早紅和小白桃(代號(hào)10)在第3外顯子區(qū)SNP和Indel變異數(shù)量非常多(圖3-A),說(shuō)明這2個(gè)品種的NAC基因結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。

    2.3 桃NAC同源蛋白及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

    Blastp檢索同源蛋白,發(fā)現(xiàn)結(jié)果中絕大多數(shù)屬于NAC類成員。桃NAC基因與梅同源性最高,為97%,其次是鴨梨NAC,為89%。其他同源性較高的來(lái)自于蘋(píng)果、月季、湖北海棠、草莓等物種。將score值最高的19個(gè)同源蛋白序列(表3)下載到本地,進(jìn)行同源性分析(圖3-E)。桃NAC(ref品種)與19種植物同源性在72%~97%之間。

    這些NAC同源蛋白比對(duì)結(jié)果顯示,在NAC結(jié)構(gòu)域保守性較高(圖3-E),在它之外則多態(tài)性較高。將桃各品種NAC氨基酸序列比對(duì)結(jié)果與其他物種同源序列比對(duì)結(jié)果結(jié)合起來(lái)分析發(fā)現(xiàn):這些物種在126位(按照ref品種序列)賴氨[CM(25]酸高度保守,而津柳早紅品種突變?yōu)榫彼幔▓D3-B、圖3-E),且其他參試品種均為賴氨酸;在191位絲氨酸高度保守,而早蟠品種為脯氨酸(圖3-C、圖3-F),且其他參試品種均為絲氨酸;在291~318位高度保守,而小白桃品種氨基酸中發(fā)生突變較多(圖3-D、圖3-G)。

    Mega 4.1生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4),各物種NAC分為3組,桃NAC與梅、鴨梨、栽培蘋(píng)果、湖北海棠、野草莓亞種、月季、川桑等聚為一組;可可、樹(shù)棉、雷蒙德氏棉、陸地棉、葡萄、胡麻等為一組;橙、克萊門(mén)柚、麻風(fēng)樹(shù)、歐洲水青岡等為一組。桃NAC與梅NAC72聚為一小支,與同源性分析結(jié)果一致。進(jìn)化樹(shù)體現(xiàn)了親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,如雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一支,橙、克萊門(mén)柚聚為一支,薔薇科果樹(shù)及木本觀賞植物形成一組等。

    3 討論

    前人研究發(fā)現(xiàn),NAC蛋白N端含有NAC結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列比較保守,C端則含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū),多樣性比較高。本研究對(duì)不同果實(shí)成熟期的桃品種NAC蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果符合上述規(guī)律:在第1、2外顯子區(qū)核苷酸變異少,其中多數(shù)是同義突變,不引起氨基酸序列變化;第3外顯子區(qū)多樣性非常豐富,而且引起的氨基酸序列變化比較多。本研究比對(duì)20個(gè)物種的NAC同源蛋白,發(fā)現(xiàn)N端氨基酸序列比較保守,而C端多樣性較高,與前人在其他物種上的研究結(jié)論一致。津柳早紅品種NAC蛋白翻譯提前終止,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活區(qū)部分缺失,可能會(huì)影響其生物學(xué)功能或效能,進(jìn)而引起果實(shí)提早成熟,但是需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。小白桃在C端存在一段特殊的氨基酸序列,有別于其他參試桃品種,具有獨(dú)特性。

    Ooka等認(rèn)為在NAC保守結(jié)構(gòu)域中包含5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E),其中A、C、D高度保守,B和E保守性不強(qiáng)[8]。前人研究發(fā)現(xiàn),在NAC蛋白中個(gè)別氨基酸突變會(huì)顯著影響其生物學(xué)功能。在擬南芥cuc1突變體中,cuc1-1蛋白在123位氨基酸處由賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸(屬于D亞結(jié)構(gòu)域),可能影響它核定位和DNA結(jié)合,致使突變體不能形成莖頂端分生組織[2,9]。本研究中,NAC同源蛋白在126位(按照ref品種序列)賴氨酸高度保守(屬于D亞結(jié)構(gòu)域),而津柳早紅品種為精氨酸;在191位絲氨酸高度保守,而早蟠品種為脯氨酸,從類型上講,從極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸,性質(zhì)變化比較大。因此,這2處變異很有可能導(dǎo)致蛋白功能或效能的明顯變化。

    不同物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析通常能獲得與基于表型性狀的植物分類學(xué)相同或相近的結(jié)果。張亮等研究了新疆栽培扁桃CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因,在對(duì)不同植物CBF氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),它與甜櫻桃、梅親緣關(guān)系最近,而且三者與野生扁桃、山桃、桃、光核桃、新疆桃等聚成一組[10]。陳清等研究黑莓RuMYB10 基因,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析同源蛋白發(fā)現(xiàn),同屬懸鉤子屬的歐洲紅樹(shù)莓與RuMYB10 分化時(shí)間很近;物種間MYB基本等同于物種分類地位:同屬薔薇科的蘋(píng)果亞科、李(梅)亞科和薔薇亞科各自聚為小枝后匯為一大類[11]。本研究中,NAC同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也體現(xiàn)了植物親緣關(guān)系,桃NAC與梅NAC72聚為一小枝,雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一枝,橙、克萊門(mén)柚聚為一枝,薔薇科植物聚成一組等。

    NAC基因是桃果實(shí)成熟期性狀的候選基因之一[7]。Eduardo等利用桃分離群體研究發(fā)現(xiàn)緩慢成熟性狀是單基因控制,它與果實(shí)成熟期性狀共分離,從NAC基因中開(kāi)發(fā)了一個(gè)SCAR標(biāo)記(PSR2)用于鑒定后代成熟性狀[12]。Nuez-Lillo等利用桃F2群體研究發(fā)現(xiàn),NAC與緩慢成熟性狀共分離,認(rèn)為NAC和ERF4 是成熟期性狀和果肉粉狀性狀的候選基因[13]。

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