龍骨對抗軟骨細胞氧化損傷和坐骨神經損傷的研究

張靖宇

(鄭州工業(yè)應用技術學院 醫(yī)學院，鄭州 451100)

龍骨，來源于古代哺乳類動物的骨骼化石，如馬、牛類、 鹿類、象類等。龍骨屬于礦物類中藥, 主要分布在我國的西南部地區(qū),全株入藥。其主要功效有舒筋活絡和祛風除濕，民間用于治療風濕性關節(jié)炎、跌打損傷、胃痛病等[1]。骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是臨床中常見的疾病，骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制一直是研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，龍骨具有較強的促進骨傷愈合的功能[2]。本文對中藥龍骨對骨關節(jié)炎軟骨細胞的氧化損傷是否具有可逆作用，是否具有促進受損傷神經組織功能修復的作用進行研究，期望找到可能治療骨關節(jié)炎的藥物，為骨關節(jié)炎治療提供藥物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料

健康 6 月齡新西蘭大白兔30只，雌雄各半，空腹體重2.5kg左右。小鼠40只，雌雄各半，體重 20g左右。實驗材料由上海生旺實驗動物有限公司提供(SCXK-2008-0002)，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的 《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

1.1.2 藥品與試劑

將中藥龍骨過100目篩、煎煮2h, 制成龍骨水煎劑。

主要化學試劑：活性氧檢測試劑盒、 NO檢測試劑盒、IL- 1β、TNF α 放免試劑盒、低熔點瓊脂、戊巴比妥鈉等。其他為分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠抗軟骨細胞氧化損傷模型

將30只大白兔分為5組，分成對照組、模型組、添加龍骨水煎劑低劑量組、添加龍骨水煎劑中劑量組、添加龍骨水煎劑高劑量組，每組6只[3]。正常對照組由大白兔手術分離獲得，10%IMDM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；骨關節(jié)炎模型組分 4 組，由動物造模組獲得，模型組 10%IMDM 正常培養(yǎng)。添加龍骨水煎劑低劑量組10 μg/mL龍骨水煎劑，添加龍骨水煎劑中劑量組20 μg/mL龍骨水煎劑，添加龍骨水煎劑高劑量組40 μg/mL龍骨水煎劑。

兔骨關節(jié)炎動物模型的建立采用改良Hulth法[4]。主要是切斷內側副韌帶、前后交叉韌帶、切除大白兔內側半月板。將大白兔仰臥、四肢固定于手術臺上，脫毛，消毒，取雙后膝關節(jié)內側橫向切口，打開關節(jié)腔，切斷內側副韌帶，探查關節(jié)腔無原發(fā)病變后，切斷前交叉韌帶，全部切除內側半月板造模，逐層縫合切口。對照組操作同前，但不切斷前交叉韌帶和切除內側半月板。一籠一兔喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間對大白兔進行訓練，每天行走半小時。每周重復完成一組模型，共4周。第5周開始，每周處死一組動物，得到大白兔的軟骨細胞，培養(yǎng)，測定數(shù)據(jù)，連續(xù)4周。

1.2.2 軟骨細胞提取與培養(yǎng)

將大白兔固定后，處死，截取膝關節(jié)，浸入無菌液體。截取關節(jié)表面軟骨，放入盛有D-Hank＇s無菌平皿中。后放入IMDM 培養(yǎng)液中，2000 r/min 離心 10min。收集離心后軟骨，加入胰蛋白酶，37℃消化30 min。離心收集沉淀放入4 mL 0.2%膠原酶中。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h。2000 r/min 離心 10min，收集沉淀，放入IMDM 培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，置 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.2.3 軟骨細胞中活性氧(ROS)的測定

選擇DCFH-DA 法檢測細胞內活性氧水平。稀釋 DCFH -DA達到1∶ 1 000倍，終濃度是10μm。細胞液放入DCFH-DA稀釋液中。細胞濃度在15×106/mL。每隔一段時間搖晃一次。30min后用無血清培養(yǎng)液，除去DCFH-DA稀釋液。流式細胞儀488nm光激發(fā)，525nm檢測發(fā)射光強度，計數(shù)1萬個細胞，檢測細胞內平均熒光強度反應活性氧水平[6]。

1.2.4 NO、SOD 和 GSH-Px 含量的測定

將軟骨細胞接種在24孔板中，每隔孔板0.5mL，重復6組。培養(yǎng)72小時后，細胞貼壁，用龍骨水煎液培養(yǎng)48h，收集上清液，5 000 r/min離心 10 min，取上清液凍存。

NO檢測：采用Griess 法，以NaNO2為標準品，0，1，2，5，10，20，60 μm濃度不同繪制標準曲線，酶標儀檢測樣品，計算樣品中亞硝酸鹽的濃度，就是溶液中 NO濃度[7]。

SOD采用黃嘌呤氧化酶法。用可見分光光度計檢測吸光度，當被測樣品中含SOD 時,對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用, 減少亞硝酸鹽的形成,通過公式計算可求出被測樣品中的SOD 活力[8]。

GSH-Px 含量采用DTNB法測定[9]。

1.2.5 抗坐骨神經損傷測定

實驗分成2個小組，連續(xù)給小鼠用藥4天。第5天麻醉小鼠，分離小鼠坐骨神經，形成坐骨神經損傷的動物模型。術后小鼠每天連續(xù)給灌服龍骨水煎劑, 持續(xù)2周。在術后第3周開始將小鼠放置在鼠籠上，記錄小鼠爬網(wǎng)漏出鼠腳次數(shù)。每隔1周觀察一次，每次5分鐘[10]。

2 結果

2.1 軟骨細胞中 ROS 測定

對照組ROS平均測定是6.67±0.12，模型組ROS平均測定是13.56±0.44。兩組相比較P值<0．001，說明骨關節(jié)炎軟骨細胞中存在氧化損傷情況。龍骨水煎劑低、中、高劑量組為10.54±0.31、9.14±0.72、7.89±0.91。模型組與龍骨水煎劑低、中、高劑量組相比較P值均<0．001，而且龍骨水煎劑低、中、高劑量組兩兩相比較顯著性小于0.001和0.05。實驗結果表明，加入劑量不同的龍骨水煎劑后，存在降低骨關節(jié)炎軟骨細胞中活性氧水平的情況，并且隨著龍骨水煎劑劑量的增加，骨關節(jié)炎抗氧化損傷作用增強，出現(xiàn)了一定劑量的依賴性情況。

2.2 軟骨細胞中 NO、SOD 和 GSH-Px 測定

表1 龍骨水煎劑對軟骨細胞培養(yǎng)上清中 NO、SOD 和 GSH-Px的影響Tab.1 The effect of the keel water decoction on the cultivation of chondrocytes on the NO, SOD and GSH-Px

表1顯示，NaNO2檢測結果模型組與龍骨水煎劑低劑量組、中劑量組和高劑量組相比，都是P<0.01，極顯著。龍骨水煎劑三個組分兩兩比較，P>0.05，不顯著。正常對照組相比較下，從骨關節(jié)炎軟骨細胞培養(yǎng)情況看出，NO含量升高，說明骨關節(jié)炎軟骨細胞上存在著氧化損傷情況。在龍骨水煎劑處理下骨關節(jié)炎軟骨細胞中的NO存在下降情況，說明龍骨水煎劑能減輕細胞的氧化損傷。

表1顯示SOD 檢測結果，模型組與龍骨水煎劑低劑量組、中劑量組和高劑量組對比，P<0.05顯著。龍骨水煎劑三個組分兩兩比較，P>0.05，不顯著。GSH-Px 檢測結果，模型組與龍骨水煎劑低劑量組相比，P>0.05，不顯著。模型組與中劑量組和高劑量組相比，P<0.01，極顯著。龍骨水煎劑三個組分兩兩比較，P<0.05，顯著。正常對照組相比較下，骨關節(jié)炎軟骨細胞培養(yǎng)情況看出，SOD、GSH-Px 含量明顯降低，說明細胞的抗氧化能力減弱。隨著龍骨水煎劑濃度的增加，SOD 和 GSH- Px 有升高趨勢，說明細胞的抗氧化能力增強。龍骨水煎劑在一定范圍內能提高軟骨細胞的抗氧化能力。

2.3 抗坐骨神經損傷測定

表2 龍骨對小鼠坐骨神經損傷后步態(tài)恢復的影響Tab.2 The effect of keel on gait recovery after sciatic nerve injury in mice %

由表2看出，隨著小鼠灌胃龍骨水煎劑后，小鼠漏腳率逐漸下降，且低于生理鹽水。在連續(xù)灌服龍骨水煎液后，小鼠坐骨神經損傷后步態(tài)在第4、第5周時明顯減少，說明龍骨水煎劑作用于小鼠坐骨神經后，具有促進受損傷神經組織功能修復的作用。

3 結語

本文對大白兔的骨關節(jié)軟骨細胞進行NO 、SOD和GSH-Px 測定，確定含量的變化。對照組和模型組顯示，軟骨細胞中存在氧化損傷現(xiàn)象。加入龍骨水煎劑后，對骨關節(jié)炎軟骨細胞的氧化損傷存在可逆現(xiàn)象，也就是說有逆轉作用。隨著龍骨水煎劑濃度的增加，氧化損傷逐漸減小，說明龍骨水煎劑能保護骨關節(jié)炎中的軟骨細胞。在對小鼠抗坐骨神經損傷測定方面，在連續(xù)灌服龍骨水煎液后，小鼠坐骨神經損傷后步態(tài)明顯減少，說明龍骨水煎劑作用于小鼠坐骨神經后，具有促進受損傷神經組織功能修復的作用。這一結果對治療和修復骨關節(jié)炎有一定的作用，臨床應用前景廣闊。