江西省2438例急性呼吸道感染兒童中人偏肺病毒感染分析

劉師文，李健雄，龔甜，張艷妮，施勇，肖芳，徐剛，周珺，劉曉慶，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心疾病檢測(cè)所，江西 南昌 330029)

2001年荷蘭學(xué)者Vanden Hoogen等[1]從患急性下呼吸道感染的嬰幼兒鼻咽抽吸物樣本中分離到一種新的病毒，人偏肺病毒 (human metapneumovirus，HMPV)，隨后在世界各地都發(fā)現(xiàn)該病毒的流行[2]。進(jìn)一步研究表明，HMPV可導(dǎo)致各年齡組呼吸道感染，輕度的臨床表現(xiàn)包括咳嗽，呼吸困難，喘息/喘鳴等，嚴(yán)重的癥狀包括支氣管炎和肺炎伴隨發(fā)熱，在幼兒、老人、免疫功能低下人群還可引起致命的并發(fā)癥[3]。

HMPV是屬于副黏液病毒科偏肺病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒。基因組全長(zhǎng)約13kb包含8個(gè)基因開放讀碼框架，其編碼順序?yàn)?`-N-P-M-FM2-SH-G-L-5`，編碼9種蛋白，其中M2基因編碼兩種蛋白分別為M2-1、M2-2。9種蛋白分別命名為：N核衣殼RNA結(jié)合蛋白、P核衣殼磷蛋白、M非糖基化基質(zhì)蛋白、F融合蛋白、M2-1轉(zhuǎn)錄延伸因子、M2-2 RNA合成調(diào)節(jié)因子、SH小疏水表面蛋白、G主要黏附蛋白、L主要多聚酶亞單位。對(duì)多個(gè)基因進(jìn)化分析顯示，hMPV分為A、B兩個(gè)不同的基因型，每型內(nèi)又可分為兩個(gè)不同的亞型即(A1、A2和 B1、B2)[4，5]。 F基因表達(dá)的融合蛋白是 HMPV主要抗原，是目前分型最常用的基因[6]。本研究對(duì)江西省2010-2016年采集的急性呼吸道感染患兒標(biāo)本進(jìn)行HPMV核酸檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行F基因測(cè)序和分析，以了解江西地區(qū)HMPV流行情況和基因特征。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 于2010年4月至20106年12月每周二定點(diǎn)采集江西省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診和住院的急性呼吸道患兒的咽拭子或支氣管灌洗液，并收集病例相關(guān)資料和臨床信息。

1．2 主要試劑 病毒DNA和RNA提取試劑（QIAGEN），核酸擴(kuò)增試劑盒（QIAGEN和Promaga Go-Taq Master Mix）。

1．3 樣本處理和核酸提取 方法參照文獻(xiàn)[7]。

1．4 HMPV 核酸檢測(cè)（P基因） 引物 F 5’-TYAA CATTGCWACAGCAGGACC-3’，引物 R 5’-CTTC WGATTCWCCRCTTGTGCT-3’。 RT 反 應(yīng) ：50℃30min，95℃ 15min；PCR 循環(huán)如下：94℃ 30s，54℃30s，72℃ 1min， 共 擴(kuò) 增 35 個(gè) 循 環(huán) ，72℃ 延 伸10min。

1．5 HMPV F 基因擴(kuò)增和測(cè)序 引物 Ff：5’-GTYA GCTTCAGTCAATTCAACAGAAG-3’，F(xiàn)r：5’-CCTG TGCTGACTTTGCATGGG-3’。反應(yīng)條件：RT反應(yīng)：50℃ 30min，95℃ 15min；PCR 循環(huán)如下：94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1min， 共擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1．6 分析方法 采用SPSS 18．0軟件對(duì)病例信息及檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用DNAStar和MEGA6．0軟件F基因序列進(jìn)行分析，以鄰位相連法(neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2．1 HMPV檢測(cè)結(jié)果 2010年 4月至 2016年 12月，共采集2438例急性呼吸道感染患兒呼吸道標(biāo)本，其中有54例患兒樣本被檢出HMPV核酸陽(yáng)性，陽(yáng)性率為 2．21%。

2．2 不同月份HMPV檢測(cè)結(jié)果 1-12月不同月份HMPV陽(yáng)性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35．723，P=0．000188＜0．05），其中發(fā)病季節(jié)主要為冬春季，高發(fā)月份為12月、1月、2月、3月。見表1。

表1 不同月份HMPV核酸檢測(cè)情況

2．3 HMPV感染兒童年齡分布 從病例年齡分布看0～5歲病例共49例，占總病例數(shù)90．74%，不同年齡組之間HMPV陽(yáng)性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12．876，P=0．302＞0．05）。 見表 2。

表2 不同年齡組HMPV檢出情況

2．4 不同性別患兒HMPV檢測(cè)結(jié)果 不同性別HMPV 陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0．394，P=0．530＞0．05）。 見表 3。

2．5 江西地區(qū)HMPV基因型分型 對(duì)54份HMPV陽(yáng)性樣本進(jìn)行F基因擴(kuò)增測(cè)序，最終成功獲得28株病毒的F基因序列，應(yīng)用MEGA6．0和 DNA STAR軟件包進(jìn)行序列分析，根據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行基因分型，其中21株為A2基因型，B1基因型3株，B2基因型4株，系統(tǒng)發(fā)生樹見圖1。

表3 不同性別組HMPV檢出情況

圖1 江西地區(qū)HMPV流行株F基因片段鄰位相鄰法系統(tǒng)發(fā)生樹（613-1064bp）。

3 討論

人類偏肺病毒可導(dǎo)致人類上呼吸道和下呼吸道感染，尤其是在小于5歲嬰幼兒、老人和免疫力低下者中引起細(xì)支氣管炎和肺炎[8]，在下呼吸道感染中，僅次于呼吸道合胞病毒[4]。該病毒自2001年首次被發(fā)現(xiàn)以來受到了國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。我國(guó)2003年朱汝南[9]等首先報(bào)道了國(guó)內(nèi)HMPV感染情況，之后，國(guó)內(nèi)其他等地相繼也有類似報(bào)道[10-12]，但目前還未見江西地區(qū)該病毒感染情況的研究報(bào)道。本研究對(duì)2010-2016年江西地區(qū)采集的2438例兒童急性呼吸道本進(jìn)行了HMPV核酸檢測(cè)，檢出陽(yáng)性54例，陽(yáng)性率為2．21%，說明它確實(shí)是引起江西地區(qū)兒童急性呼吸道感染的重要病原之一。陽(yáng)性病例在各個(gè)不同月份間人偏肺病毒檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要流行月份在12月和1-3月，流行季節(jié)為冬春季，結(jié)果與金玉報(bào)道的相符[13]；本研究中，小于5歲總病例數(shù)90．74%；分析未發(fā)現(xiàn)該病毒在兩性別間的感染有顯著差異，結(jié)果與徐梅佳[14]的報(bào)道相符。

HMPV分為A、B兩個(gè)不同的基因型，每型內(nèi)又可分為兩個(gè)不同的亞型即(A1、A2和 B1、B2)，有研究表明，兩種hMPV基因型可在同一季節(jié)里共同流行，且以A基因型為多，hMPV基因型的流行模式在同一區(qū)域的不同年份可能不斷變化；朱汝南[9]報(bào)道2003年和2004年北京地區(qū)流行的hMPV分屬于兩種基因亞型（A2和B2），湖南地區(qū)hMPV樣本分屬于四種亞型（A1、A2、B1、B2），且以 B 基因型為多[15]。本研究共測(cè)序獲得28株人偏肺病毒的F基因序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，江西地區(qū)流行的人偏肺病毒有A2、B1、B2基因型，A2基因型毒株每年都有檢測(cè)到，我們推測(cè)A2基因型毒株為江西本土的優(yōu)勢(shì)流行株。不同基因型與臨床表現(xiàn)的關(guān)系我們還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究證實(shí)hMPV是引起江西地區(qū)兒童急性呼吸道感染的重要病原之一，掌握了江西地區(qū)的hMPV流行規(guī)律及基因分型特征，對(duì)提高江西地區(qū)人偏肺病毒的防控有重要意義。