建立梯度模型探討溶血對(duì)TMA核酸檢測(cè)的影響

田耘博，魏蘭，李維，歐陽(yáng)熊妍

(重慶市血液中心，重慶 400015)

血液病毒核酸檢測(cè)（nucleic acid testing，NAT）直接檢測(cè)病毒核酸，與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相比能縮短血液病毒檢測(cè)的窗口期，更好地保障血液安全，已成為許多國(guó)家血液篩查病毒的必要手段[1，2]，目前我國(guó)也已全面開展血液病毒核酸檢測(cè)[3]。標(biāo)本采集、處理、保存等因素對(duì)保證NAT檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要[4]。若標(biāo)本采集、處理不當(dāng)可能導(dǎo)致溶血，血漿中Hb可能會(huì)影響血液病毒核酸檢測(cè)的有效性和準(zhǔn)確性[5-7]。如果實(shí)驗(yàn)室一概拒收溶血標(biāo)本，重新采集標(biāo)本可能會(huì)非常困難，甚至?xí)绊懷旱挠行Ъ皶r(shí)供給，產(chǎn)生或增大血液供給矛盾。從母袋內(nèi)重新留樣進(jìn)行ELISA和NAT檢測(cè)，有可能因抗凝劑的稀釋造成弱陽(yáng)性標(biāo)本漏檢[8]；除了稀釋的影響外，母袋重新留樣還可能面臨核酸降解及污染的問題。因此，探討標(biāo)本溶血對(duì)NAT檢測(cè)結(jié)果的影響意義重大，可為實(shí)驗(yàn)室提供可接受的溶血范圍，保護(hù)珍貴的血液資源。

目前應(yīng)用于血液病毒篩查的NAT技術(shù)主要有多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcription mediated amplifi-cation，TMA）技術(shù)[2]。PCR是最早應(yīng)用的核酸擴(kuò)增技術(shù)，但隨著NAT在全世界的成功推廣，TMA在NAT中的應(yīng)用范圍已不亞于PCR[9]。調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外尚無標(biāo)本溶血對(duì)基于TMA技術(shù)的NAT檢測(cè)結(jié)果影響較為詳細(xì)的研究。因此，本研究旨在通過建立梯度溶血程度和梯度病毒載量的標(biāo)本模型，分析含不同病毒載量的系列溶血程度標(biāo)本的NAT結(jié)果，探討溶血對(duì)血液病毒核酸檢測(cè)的影響，以明確溶血程度與NAT靈敏度之間的關(guān)系，為實(shí)驗(yàn)室提供可接受的溶血范圍，保護(hù)血液資源，以促進(jìn)臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源及篩選 收集重慶市血液中心2017年5月-2017年7月經(jīng)體檢和血液初篩檢驗(yàn)合格的無償獻(xiàn)血標(biāo)本500份，分別用含分離膠的“非可替”抗凝真空管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集6～8ml全血用于NAT檢測(cè)；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集4～5ml全血用于ELISA檢測(cè)。采集后的標(biāo)本管置于4℃保存，在采集4～6h內(nèi)2000g離心15min，檢測(cè)前置于4℃保存，分別進(jìn)行ELISA和NAT。挑選ELISA和NAT均為非反應(yīng)性的標(biāo)本，封口膠密封后4℃保存，1周內(nèi)使用。本研究方案獲得重慶市血液中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1．2 主要儀器 TEKEN RSP150/200型全自動(dòng)加樣儀（瑞士TEKEN公司）和FAME 2420/30全自動(dòng)酶免 分 析 儀 （瑞 士 HAMILTON公 司 ）、Procleix TIGRIS全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng) （西班牙蓋立復(fù)公司）及配套的PRI(試劑準(zhǔn)備溫育器，美國(guó)Chiron公司)、M-series AD血細(xì)胞分析儀（瑞典MEDONIC公司）、RT3100洗板機(jī) （深圳雷杜公司）、EXL808酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK公司）、L535R離心機(jī)（湖南湘儀公司）、KQ218超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲波儀器有限公司）。

1．3 主要試劑

1．3．1 ELISA檢測(cè)試劑 乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑：北京萬(wàn)泰、英國(guó)索林；丙型肝炎病毒抗體診斷試劑：北京萬(wàn)泰、美國(guó)強(qiáng)生；HIV（1+2）P24 抗原及抗體診斷試劑：法國(guó)伯樂，HIV抗體診斷試劑：上海科華。

1．3．2 核酸檢測(cè)試劑 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1型）NAT試劑盒（TMA-化學(xué)發(fā)光法）”（Procleix Ultrio Plus Assay）， 美國(guó)Hologic公司。該試劑可同時(shí)定性檢測(cè)人類血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA和 HBV DNA，試劑盒內(nèi)含有配套的Procleix Plus HIV-1/HBV/HCV鑒別試劑。

1．3．3 病毒標(biāo)準(zhǔn)品 HIV、HCV、HBV 的血漿病毒質(zhì)控品（北京萬(wàn)泰公司），均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度分別為：HIV 200IU/ml、HCV 30IU/ml、HBV 30IU/ml。

1．4 梯度溶血程度和梯度病毒載量的實(shí)用性研究標(biāo)本模型建立

1．4．1 梯度溶血程度和梯度病毒載量 根據(jù)所用檢測(cè)試劑說明書[10]和參考類似研究[11-13]，我們將本研究的溶血程度分為5個(gè)梯度，血漿Hb濃度從低到高依次為 0g/L（肉眼觀察無溶血）、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L。因病毒載量過低時(shí)易出現(xiàn)檢測(cè)陰性，將難以判定是溶血導(dǎo)致假陰性還是低病毒載量下檢出率較低的影響，所以本研究根據(jù)試劑說明書的檢測(cè)下限和有關(guān)核酸檢測(cè)質(zhì)控品濃度設(shè)置的研究報(bào)道[14]，將病毒濃載量分為2個(gè)水平，低水平組：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml； 高 水 平 組 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml。

1．4．2 創(chuàng)建梯度溶血程度和梯度病毒載量的標(biāo)本模型 將商品化的HIV、HCV、HBV核酸檢測(cè)血漿病毒質(zhì)控品作為病毒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行稀釋建立梯度病毒載量的標(biāo)本。為避免基質(zhì)效應(yīng)[15]，采用NAT和ELISA檢測(cè)均合格的無溶血血漿作為稀釋液，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的病毒載量水平對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。

1．4．3 溶血模型的制備 取NAT和 ELISA檢測(cè)均合格的核酸標(biāo)本管中壓積紅細(xì)胞，與等量去離子水混勻后使用超聲波破碎紅細(xì)胞，具體的超聲波破碎紅細(xì)胞裝置如圖1所示，采用去離子水煮沸冷卻后制得的脫氣水作為聲傳導(dǎo)介質(zhì)[16]。具體操作流程如下：超聲波作用5min→顛倒混勻10次→超聲波再次作用5min→顛倒混勻10次→2000g離心15min→轉(zhuǎn)移上半部分液體到潔凈試管，作為溶血標(biāo)本原液，血細(xì)胞分析儀檢測(cè)其Hb濃度。用血細(xì)胞分析儀測(cè)量離心后的溶血血漿Hb濃度[17]，與已知病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品混合，通過經(jīng)檢驗(yàn)合格的無溶血血漿調(diào)節(jié)含病毒的溶血標(biāo)本體積，配制成按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Hb濃度和病毒載量。溶血程度Hb為40g/L時(shí)的具體配比見表1，其余Hb梯度濃度的配比按照設(shè)定的濃度計(jì)算，進(jìn)行配制。

1．4．4 測(cè)試標(biāo)本的準(zhǔn)備 根據(jù)試劑說明書， 每次NAT檢測(cè)需500μl樣本，為確保樣本量的充足，本研究每支測(cè)試標(biāo)本量為1ml。測(cè)試標(biāo)本管按病毒含量分為對(duì)照組（不含病毒）、低水平組、高水平組，按溶血程度（Hb 濃度）分為 0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 5個(gè)組。

表1 Hb濃度為40g/L時(shí)病毒高低水平組測(cè)試標(biāo)本的配制

圖1 超聲波致紅細(xì)胞溶血裝置示意圖

1．4．5 溶血模型的驗(yàn)證 按上述方法配制的溶血模型，在每次進(jìn)行核酸檢測(cè)前，均同時(shí)取一支對(duì)照管在血細(xì)胞分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證血紅蛋白含量是否達(dá)到預(yù)期值。

1．5 檢測(cè)過程 本研究實(shí)驗(yàn)在重慶市血液中心現(xiàn)有的NAT全自動(dòng)系統(tǒng)PROCLEIX TIGRIS上進(jìn)行，采用的配套的試劑。根據(jù)試劑盒說明書[10]，HIV、HCV、HBV病毒聯(lián)檢和鑒別檢測(cè)之間的特異性和靈敏度沒有顯著性差異。因此我們采用HIV、HCV、HBV病毒聯(lián)檢的方式進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。本研究進(jìn)行了3批次總計(jì)240個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)。每批次檢測(cè)的標(biāo)本包括HIV、HCV、HBV每種病毒的高低2個(gè)病毒載量水平，每個(gè)水平分別包括Hb 5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 4個(gè)梯度濃度，每個(gè)梯度濃度的標(biāo)本平行配制3管；Hb為0g/L，即不溶血時(shí)，高病毒載量水平組能確定檢出[10，14]，因此只配制了低病毒載量水平組，每種病毒1個(gè)，用作研究測(cè)試的質(zhì)控管；在每批次測(cè)試時(shí)，對(duì)每個(gè)Hb的梯度濃度級(jí)別，均配制1個(gè)不含病毒的對(duì)照管，因此每批的測(cè)試標(biāo)本數(shù)為80個(gè)。具體核酸檢測(cè)操作參見相關(guān)核酸檢測(cè)研究文章[18]。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 將各測(cè)試標(biāo)本的數(shù)據(jù)輸入電腦，采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行記錄，用SAS8．1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。溶血模型的Hb濃度驗(yàn)證進(jìn)行總體均數(shù)的區(qū)間估計(jì)，采用t檢驗(yàn)的方式進(jìn)行均值顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平α=0．05，P＜α為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 溶血標(biāo)本的驗(yàn)證結(jié)果 本研究所建立的Hb梯度濃度溶血模型中的Hb濃度，均在95%的置信區(qū)間范圍內(nèi)，P值均大于α，因此，每個(gè)Hb梯度內(nèi)各標(biāo)本管的Hb濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 溶血標(biāo)本驗(yàn)證測(cè)試結(jié)果

2．2 核酸檢測(cè)結(jié)果 本研究3個(gè)測(cè)試批次，每批次80個(gè)，共計(jì)240個(gè)測(cè)試標(biāo)本。Hb分別為0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 的梯度濃度， 病毒載量分別是 高 水 平 組 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml， 低 水 平 組 ：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml，共225個(gè)測(cè)試標(biāo)本，均呈反應(yīng)性。對(duì)照管（未加病毒的測(cè)試標(biāo)本）均呈非反應(yīng)性。見表3。

3 討論

目前在研究溶血對(duì)核酸檢測(cè)影響的報(bào)道中[11-13，19]，采用的溶血方式多為反復(fù)凍融、機(jī)械破壞等，這些方法耗時(shí)較長(zhǎng)，雖能將紅細(xì)胞膜破壞，但也容易導(dǎo)致Hb的變性。在本研究中，利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)破碎紅細(xì)胞致紅細(xì)胞溶血，建立溶血模型，操作時(shí)間較短，可提高研究實(shí)驗(yàn)的效率。超聲波致紅細(xì)胞溶解的最佳條件需要的聲強(qiáng)不高[16]，因此利用超聲波清洗儀的超聲波能量，即可對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行破壞釋放出其內(nèi)的血紅蛋白，制得溶血標(biāo)本。為保證超聲波的傳導(dǎo)效果，減少超聲波由于空化機(jī)制在超聲波清洗儀容器內(nèi)液體中傳導(dǎo)的能量耗損，我們將去離子水通過煮沸后冷卻的方式制成脫氣水，作為聲波傳導(dǎo)介質(zhì)[16]，比單用普通去離子水更利于聲能傳導(dǎo)，進(jìn)一步提高了細(xì)胞破碎效率。而在制備溶血標(biāo)本原液時(shí)，由于超聲波在全血中的聲能衰減比水中大，為了減少不必要的聲衰減，提高超聲破碎細(xì)胞的效能，同時(shí)為了避免完全用壓積紅細(xì)胞破碎后形成的溶血標(biāo)本粘度大而難以定量吸取的問題，采用等量去離子水稀釋混勻紅細(xì)胞后再用超聲波破碎。充分破碎紅細(xì)胞后離心，紅細(xì)胞碎片沉降到底部，但離心后標(biāo)本溶血程度較重，難以肉眼分辨細(xì)胞碎片和上層液體的分界線，為盡量避免在吸取溶血標(biāo)本原液時(shí)吸入紅細(xì)胞碎片，只吸取離心后的上半部分液體。

表3 測(cè)試標(biāo)本管分組檢測(cè)結(jié)果

目前，有較多的關(guān)于溶血對(duì)核酸檢測(cè)影響的研究報(bào)道，但基本上都集中在基于PCR技術(shù)的NAT 方面[11-13，19，20]。這些研究中設(shè)置的 Hb 濃度范圍各不相同，多數(shù)在20g/L之內(nèi)，但有的甚至高達(dá)240g/L，正常人的Hb通常在160g/L，即便全部溶血，也很難達(dá)到那么高。因此，本研究在廣泛查閱類似研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合所用TMA核酸檢測(cè)技術(shù)和工作的實(shí)際情況，將最高溶血濃度設(shè)定在40g/L。從5g/L開始研究，也是基于說明書中明確指出該溶血程度不會(huì)影響檢測(cè)效果[10]。通過本研究建立Hb濃度梯度模型，每次檢測(cè)前同時(shí)進(jìn)行的Hb濃度檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值均小于α，因此每個(gè)Hb梯度濃度的各標(biāo)本Hb濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明實(shí)際的溶血程度達(dá)到了預(yù)期要求。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶血程度達(dá)到Hb 40g/L時(shí)，仍然對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。這個(gè)范圍遠(yuǎn)高于試劑說明書中Hb≤5g/L時(shí)對(duì)檢測(cè)沒有影響的限度。說明基于TMA的NAT對(duì)標(biāo)本溶血具有較強(qiáng)的抗干擾能力。而對(duì)基于PCR的NAT，當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)溶血時(shí)紅細(xì)胞破碎釋放出游離Hb及其衍生物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重降低PCR擴(kuò)增效率，直接影響NAT檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[21，22]。溶血對(duì)PCR的影響原因，主要是Hb中的血紅素或其代謝產(chǎn)物是DNA聚合酶的抑制劑[23]。有研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)本輕度溶血時(shí)對(duì)HBVDNA定量結(jié)果無明顯影響，但重度溶血時(shí)存在顯著性影響，且溶血會(huì)影響HBV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)準(zhǔn)確性[24]。

TMA核酸檢測(cè)技術(shù)是在等溫條件下以雙鏈DNA為模板直接轉(zhuǎn)錄出RNA，最后將擴(kuò)增的產(chǎn)物——RNA通過雜交保護(hù)分析 （hybridization protection assay，HPA）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，對(duì)于HPA，其采用的化學(xué)發(fā)光材料為吖啶酯 (Acridinium ester，AE)[10]。在堿性條件下，吖啶酯分子受到過氧化氫（H2O2）攻擊可生成二氧乙烷，二氧乙烷不穩(wěn)定，分解為CO2和電子激發(fā)態(tài)的N-甲基吖啶酮，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為430nm的光[25]。而Hb的最強(qiáng)烈光吸收主要是由血紅素引起的，在近紫外光 和 可 見 光 主 要 有 578nm、540nm、416nm和342nm四條譜帶（圖2），而416nm的吸收強(qiáng)度比其它幾條譜帶高10倍以上[26]。由于TMA檢測(cè)發(fā)出的信號(hào)波長(zhǎng)430nm和Hb的最大吸收波長(zhǎng)416nm很接近，如有微量Hb也可能對(duì)HPA帶來極大的影響。TMA與核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid se-quence based amplification，NASBA）技術(shù)原理基本一致，而在NASBA方式進(jìn)行的病毒NAT中，發(fā)現(xiàn)溶血對(duì)NAT有明顯的抑制作用[27]。在用TMA技術(shù)對(duì)遺體捐獻(xiàn)者的血液標(biāo)本進(jìn)行HIV檢測(cè)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)溶血對(duì)NAT有小而顯著的影響，導(dǎo)致NAT檢測(cè)，甚至重復(fù)檢測(cè)都會(huì)無效[28]。

圖2 Hb的吸收光譜

本研究表明，在Hb濃度≤40g/L時(shí)，溶血對(duì)TMA技術(shù)的核酸檢測(cè)沒有明顯影響，其原因可能是在TMA的第一步靶核酸捕獲中，會(huì)對(duì)沒有結(jié)合到磁珠上的非靶核苷酸物質(zhì)如Hb進(jìn)行反復(fù)的洗脫，將結(jié)合病毒核酸分子的磁珠與樣品中的其他成分分離，很大程度上消除了Hb的影響。此外，本研究所用的Procleix Ultro Plus試劑比Procleix Ultro試劑更為靈敏[29]，在成分上增加了強(qiáng)堿LiOH[30]，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用更強(qiáng)，可進(jìn)一步消除Hb的影響。

綜上，本研究提示在實(shí)際的血液病毒核酸檢測(cè)中，采用TMA技術(shù)的NAT在標(biāo)本血漿Hb濃度≤40g/L時(shí)，標(biāo)本溶血對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果無顯著性影響。這與其檢測(cè)原理和所用試劑成分相關(guān)。但本研究尚有不足之處，測(cè)試標(biāo)本量不夠大、未與PCR檢測(cè)原理的核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行平行對(duì)比、未考慮稀釋樣本濃度的溯源性，這些問題都有待進(jìn)一步研究完善。