丙型肝炎流行病學(xué)及臨床檢驗技術(shù)研究進展

唐立紅，楊桂淇，陳潔晶，龔蔚蔚 綜述，歐明林 審校

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院中心實驗室、廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林541002)

丙型肝炎（丙肝）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一種以肝損害為主的主要經(jīng)血液傳播的一組全身性傳染病疾病[1]。HCV的傳播途徑較多[2-5]，除了通過血液傳播之外，也可以通過性傳播、家庭內(nèi)接觸和母嬰傳播，此外，目前仍有很多HCV患者感染傳播途徑不能明確，這體現(xiàn)了HCV傳播途徑具有綜合性和隱匿性[6]。經(jīng)統(tǒng)計，全球約有1．85億人感染HCV，感染率約為3%，此外，每年新發(fā)HCV感染的病例有300～400萬例左右[7，8]。 在中國，HCV 的感染率約 3．2%，高于世界的平均水平，有約4000萬例感染患者，是世界上HCV感染者最多的國家之一[9，10]。有研究報告指出[11，12]，約有70%的患者可發(fā)展成慢性丙型肝炎，約有20%左右的慢性丙肝患者可能發(fā)展成慢性肝病、肝硬化或者肝細(xì)胞癌。目前，在臨床上還沒有研制出專門有效的丙型肝炎疫苗，因此，尋找靈敏的HCV檢驗途徑、積極預(yù)防并做到早發(fā)現(xiàn)早治療是避免丙肝發(fā)病、影響人類健康最佳方式[13]。本文就目前HCV流行情況及臨床上常用檢測技術(shù)的研究進展進行簡要綜述。

1 HCV基因組的結(jié)構(gòu)和特點

HCV是黃病毒科丙型肝炎病毒屬的一類單股正鏈 RNA病毒，全長約 9．6kb，HCV基因組由341bp的5′非編碼區(qū)和27kb的3′非編碼區(qū)組成，在5′非編碼區(qū)下有一可對多聚蛋白前體進行編碼的開放閱讀框（open reading frame，ORF），可編碼種類約3000種[14]。經(jīng)過多方面的相互作用影響后裂解形成3種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（E1、E2糖蛋白和核心蛋白）和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）[15]，它們分別對病毒顆粒的編碼、復(fù)制及合成發(fā)揮著重要的作用。HCV基因組具有高度的異質(zhì)性，E1和E2區(qū)域是最可變的，而3'UTR和5'UTR和末端區(qū)段高度保守[16]。據(jù)估計，在慢性感染者中，每天大約產(chǎn)生1012個病毒顆粒，這種顯著的復(fù)制率與高度易錯率，使得病毒聚合酶活性相結(jié)合時容易產(chǎn)生遺傳多樣性。見圖1。

圖1 丙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)物模式圖[17]

2 丙型肝炎在國內(nèi)外的流行現(xiàn)狀

HCV感染通常具有隱匿性，且有超過50%的感染者會發(fā)展成丙型肝炎，其中有1/10的感染者將進一步發(fā)展成肝硬化甚至是肝癌[9]。此外，有研究顯示[18]，在這些患者中1%～3%可發(fā)展成肝癌，因此臨床預(yù)防和早診斷早治療極其重要。據(jù)WHO報告，丙肝流行率平均為3．0%，而且每年新發(fā)HCV感染約300～400萬例，估計有慢性HCV感染者約1．3～1．7 億，每年導(dǎo)致 35～50 萬患者死亡[19]。 在不同的國家和地區(qū)，HCV感染率差異很大。歐洲的流行率為1%，非洲的流行率為5．3%。劉麗[20]在研究HCV感染孕婦中的流行情況中說明，蘇丹孕婦（0．6%）、沙特孕婦（0．7%）、瑞士孕婦（0．71%）、倫敦孕婦（0．8%）低于普通人群的流行率（2．2%～2．3 %）；也門孕婦（8．5%）、埃及孕婦（8．6%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群的流行率。有資料顯示[21]，我國丙肝發(fā)病率在2004-2011年期間翻了一倍，發(fā)病率逐年上升。2004年的39381例增加到了2011年的73872例；男性的發(fā)病率超過女性；報告病例主要集中地區(qū)在西北、東北、華北和華中，西北發(fā)病率最高，而西北發(fā)病率最高的省份是新疆，華東地區(qū)發(fā)病率最低。文獻分析發(fā)現(xiàn)發(fā)病率的差異可能與該地區(qū)不潔輸血史、吸毒有關(guān)[22]；廣西16歲以上高中生HCV感染情況調(diào)查[23]顯示，男生抗-HCV陽性率為0．73%(6/823)，女生陽性率為 0．89%(16/1800)，感染率從高到低依次是東部(玉林，1．03%）、中部(柳州，1．28%)、北部(桂林，0．79%)、西部(百色，0．66%)、南部(南寧，0．54%)，公用牙刷史和內(nèi)窺鏡檢查其感染的高危因素。

3 丙型肝炎的檢測方法及原理

丙型肝炎的檢測方法包括初篩試驗和確認(rèn)試驗，主要有化學(xué)發(fā)光試驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、免疫印跡試驗、膠體金快速試驗和HCVRNA檢測試驗等。目前，臨床對HCV感染的診斷方法主要是以HCV抗體和HCV-RNA檢測，而HCV抗體的檢測主要是使用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析（CMIA）和ELISA檢測方法；HCV-RNA檢測主要是使用PCR-熒光探針法進行檢測。

3．1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）間接法ELISA是抗-HCV檢測的常用篩查方法。原理是以HCV抗原包被固體載體，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG與被檢樣品中的抗-HCV反應(yīng)，以鄰苯二胺（OPD）等底物顯色后，利用酶標(biāo)儀等儀器對結(jié)果進行陰陽性判定。其主要反應(yīng)過程如下：將待測樣本加入已包被抗原的反應(yīng)孔內(nèi)進行孵育，如標(biāo)本中含有抗-HCV，則與微孔中的抗原形成固相抗原抗體復(fù)合物；因其他免疫球蛋白及樣品中的雜質(zhì)不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中將被洗去；加酶結(jié)合物經(jīng)過孵育后，酶結(jié)合物連接在抗原抗體復(fù)合物上，經(jīng)洗滌后，在TMB底物參與反應(yīng)的條件下產(chǎn)生顯色反應(yīng)，加入終止液，利用MK3酶標(biāo)儀進行測量分析結(jié)果[24]。

ELISA檢測出現(xiàn)假陽性的原因主要有以下幾點：⑴試劑的原因?？乖患?、多克隆抗體和酶結(jié)合物純度低等應(yīng)為生產(chǎn)廠家著重解決的問題；⑵患者的原因?；颊哐獦尤苎蛘咴l(fā)病中有類風(fēng)濕因子、高免疫蛋白、超氧化物歧化酶等存在；⑶檢驗人員的原因。操作不規(guī)范，洗板針堵塞、抽吸不全或注液量不足等。張力[25]探討HCV抗體ELISA 檢測 1＜S/CO 均值＜3．8時假陽性問題中，第一次檢測和第二次檢測（2～6月之間再抽血）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為HCV抗體ELISA檢測存在假陽性時應(yīng)定期復(fù)查或做其它檢測。陳紅[26]認(rèn)為抗-HCV ELISA檢測單試劑陽性標(biāo)本假陽性高，因此丙肝ELISA檢測灰區(qū)設(shè)置有其必要性，但設(shè)置的范圍有待于進一步的探討。

3．2 化學(xué)發(fā)光試驗 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析（CMIA）能夠?qū)⒕哂懈叨褥`敏的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等檢測分析技術(shù)[27]。其檢驗原理是：HCV采用免疫檢測，定性測定人血漿和血清中的HCV抗體，將化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法和靈活的而檢測方案相結(jié)合的一種技術(shù)。首先是將樣本中的HCV重組抗原包被的順磁微粒子和項目稀釋液混合，使得樣本中的HCV抗體HCV包被的微粒子上；然后進行沖洗，加入吖啶酯標(biāo)記的結(jié)合物，再次進行沖洗并向反應(yīng)混合物中加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液。最后通過反應(yīng)中的發(fā)光信號的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進行測量HCV抗體的含量，從而獲得樣本中HCV抗體的含量。樣品中HCV抗體的含量和雅培全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（型號ARCHITECT i2000）光學(xué)系統(tǒng)檢測到的RLUs值成正比。該方法操作快速、簡單、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。

化學(xué)發(fā)光法擁有靈敏度高、特異性高、沒有放射性等優(yōu)點，但同時存在較高的假陽性率，可能是檢測時存在其他抗體的干擾，比如類風(fēng)濕類抗體；或者標(biāo)本狀態(tài)的影響，比如標(biāo)本乳糜、嚴(yán)重溶血、纖維蛋白原較多等。李峰[28]通過i2000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測22849例血清標(biāo)本，陽性率為0．57%，假陽性率為16．03%，假陽性率較高，對檢驗人員的操作要求更嚴(yán)格、更規(guī)范，還需相關(guān)資料進行綜合判定考慮。王正芳[29]研究抗HCV用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法（CLIA）法檢測S/CO值時，重組免疫印跡法（RIBA）確證的陽性率隨著S/CO值的增加顯著升高。

3．3 膠體金法快速試驗 膠體金法快速試驗包括免疫層析和免疫滲濾試驗。免疫層析試驗：其原理是以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質(zhì)控線必須顯色。免疫滲濾試驗：斑點免疫膠體金快速試驗是以硝酸纖維薄膜為載體，HCV抗原點狀固定在膜上，加待測檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應(yīng)時間在10min以內(nèi)。有效試驗的質(zhì)控點必須顯色[30]。

金標(biāo)法快檢的假陰性造成的因素可能是判斷結(jié)果時間不夠、反應(yīng)不充分、氣溫低、加血量過多或過少；過濾膜破損造成血液滲出濾膜使檢測線模糊，判斷失誤；判定經(jīng)驗不足，將隱約可見的陽性線判斷為陰性，或?qū)婈栃耘袛酁殛幮缘取６訇栃月瘦^低，說明陽性符合率較高，考慮因素可能是試劑因素[31]。

3．4 熒光定量PCR法 PCR法是目前檢測病毒核酸病毒最靈敏的一種直接檢測方法，可用于HCV感染早期病毒量很低時就能檢測出HCV RNA存在[32]。其原理是以HCV基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物及熒光探針，進行一步法RT-PCR擴增，用于血清或血漿樣本中HCV RNA的定量檢測。HCV RNA陽性及其病毒量的多少證明有病毒存在并提示其復(fù)制活躍程度和傳染性的強弱。動態(tài)觀察HCV RNA與抗HCV的變化，可為丙肝預(yù)后判斷和用藥療效提供依據(jù)和評價指標(biāo)。熒光定量PCR與高敏化學(xué)發(fā)光法（CIA）相比，二者均可能產(chǎn)生假陽性，但PCR檢測結(jié)果假陽性率低于CIA[33]。

4 小結(jié)

HCV在我國具有較高的發(fā)病率，經(jīng)輸血或血制品傳播可能是HCV感染的一個重要途徑[34]。HCV具有很強的隱匿性，大多數(shù)患者由于在最初感染的時候癥狀不明顯因而沒有發(fā)現(xiàn)，從而錯過了早發(fā)現(xiàn)早治療的最佳時機[35]。一般情況下，患者5年以內(nèi)的治愈率高達(dá)70%～90%，而5～10年的治愈率55%～75%左右，如10年以上的患者治愈會明顯下降[36]。就檢測方法而言，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析（CMIA）、ELISA、膠體金快速試驗和熒光定量PCR法檢測HCV-RNA等檢測方法都各具有局限性，因此可以通過比較它們的優(yōu)缺點，選用兩種或多種方法進行聯(lián)合檢測來縮短窗口期的診斷方法，降低假陰性率、漏檢率，從而達(dá)到對初期HCV感染患者進行早診斷、早治療的臨床目標(biāo)。