基于28S rDNA部分序列的金沙江德澤段鯰寄生撒氏蟲屬(Thaparocleidus)單殖吸蟲的系統(tǒng)發(fā)育*

郭苗，李寄仟，徐偉江,2，范麗仙,2

(1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650000；2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

撒氏蟲屬(ThaparocleidusJain,1952)的模式種是寄生于Wallagoattu鰓上的Thaparocleiduswallagonius[1-2].Gussev分別于1976和1978年將隸屬于11個(gè)屬(指環(huán)蟲屬DactylogyrusDiesing,1850，UrocleidusMueller,1934,錨盤蟲屬AncylodiscoidesYamaguti,1937，HaplocleidusMueller,1937，撒氏蟲屬Thaparocleidus，MizelleusJain,1957，NeomurraytremaTripathi,1959，WallagotremaTripathi,1959，偽錨盤蟲屬PseudoancylodiscoidesYamaguti,1963，ParancylodiscoidesAchmerow,1964，JainiusAchmerow,1964)的48種單殖吸蟲歸于鯰盤蟲屬(SilurodiscoidesGussev,1976)[3].依據(jù)國際慣例時(shí)間優(yōu)先原則，Lim認(rèn)為鯰盤蟲屬為撒氏蟲屬的次主觀異名，將隸屬于Silurodiscoides，Parancylodiscoides，Wallagotrema和Urocleidus的70種單殖吸蟲重新歸屬于撒氏蟲屬，確認(rèn)了撒氏蟲屬的有效性[4].在此基礎(chǔ)上，指環(huán)蟲目20個(gè)屬中保留7個(gè)有效屬，其他屬則被列為同物異名[5]，同時(shí)律定的92種撒氏蟲中有77種為有效種[6-8].我國動(dòng)物志采用鯰盤蟲屬階元進(jìn)行編目[9].國際上近年對(duì)該類群的研究及本研究采用撒氏蟲屬階元進(jìn)行編目和研究.

撒氏蟲屬單殖吸蟲的鑒定通常依據(jù)幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征：后吸器(包括錨鉤或吸鋏、邊緣小鉤、聯(lián)結(jié)片等)、雄性交接器(包括支持器及交接管)及陰道結(jié)構(gòu)等[10-13].每種單殖吸蟲的后吸器及交接器形態(tài)各異，具有種和屬的鑒定特征[14-15]，故可通過幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，即后吸器和交接器的形態(tài)及大小鑒定單殖吸蟲[16-19].撒氏蟲屬后吸器具7對(duì)胚鉤型邊緣小鉤，2對(duì)中央大鉤，其中背中央大鉤遠(yuǎn)大于腹中央大鉤，2聯(lián)結(jié)片，其中腹聯(lián)結(jié)片多呈V形等[20].然而，形態(tài)學(xué)鑒定容易受到客觀條件及確立者主觀意見的影響，如單殖吸蟲個(gè)體發(fā)育的周期[21-22]、感染方式、汲取營養(yǎng)方式[23]、宿主的差異(體型、地理分布和環(huán)境等)[24]及實(shí)驗(yàn)操作方法[23,25]等均會(huì)導(dǎo)致單殖吸蟲形態(tài)學(xué)鑒定上的問題.故僅以形態(tài)學(xué)特征作為鑒定依據(jù)易產(chǎn)生同物異名以及近似物種難以鑒定等分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究上的疑難問題.

Cunningham等首次將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于單殖吸蟲的研究[26-27]，其內(nèi)容主要包括對(duì)物種進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究遺傳演化及種間親緣關(guān)系等[26].為更好地確定撒氏蟲屬單殖吸蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，學(xué)者們進(jìn)行了廣泛的研究.吳相云基于28S rDNA部分序列的研究結(jié)果顯示寄生于廣東番禺蘇氏圓腹魚芒鯰(Pangasiumsutchi)的螺莖撒氏蟲(T.campylopterocirrus)與撒氏蟲未定種(Thaparocleidussp.BDY)聚為一枝，其余12種撒氏蟲聚為一枝，故認(rèn)為該屬為并系群[11]；imková等基于28S rDNA部分序列及18S+ITS1+5.8S聯(lián)合序列證明寄生于魚芒科(Pangasiidae)魚類的撒氏蟲為單系群[28]；而Rajvanshi等對(duì)T.devraji進(jìn)行了重新描述，并基于28S rDNA部分序列證明該屬為單系群[29].撒氏蟲屬是否為單系群有待進(jìn)一步考證.

本文基于28S rDNA部分序列對(duì)9種撒氏蟲：牛欄江撒氏蟲(T.niulanjiangensissp.nov.)、撒氏蟲屬未定種 (Thaparocleidussp.isolate G1-6)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate I3-1)、兇惡撒氏蟲(T.asoti)、奇異撒氏蟲(T.varicus)、大莖撒氏蟲(T.magnicirrus)、變形撒氏蟲(T.obscura)、多形撒氏蟲(T.mutabilis)和撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate MG-2018)進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育研究，以期探討撒氏蟲屬單殖吸蟲的分類、同物異名及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等問題.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鯰魚宿主分別于2017年6月、11～12月、2018年12月采自云南省金沙江水系牛欄江支流德澤段(N25°57′5″，E103°36′9″).將鰓絲置于生理鹽水中，在光學(xué)顯微鏡Olympus CX-41下檢獲蟲體，制作水封片于顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并利用DigiRetina 16顯微成像系統(tǒng)和TCapture Imaging Compose顯微數(shù)碼采集分析系統(tǒng)拍照并測(cè)量.隨后，將蟲體小心移至加入適量無水乙醇的1.5 mL離心管中，置于-4 ℃保存，用于分子實(shí)驗(yàn)研究.

1.2 分子鑒定

保存于無水乙醇的樣品按照美國OMEGA公司D3390-01石蠟DNA試劑盒提取其DNA，并對(duì)28S rRNA基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)的上游引物為C1[30]：5′-ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3′；下游引物為D2[31]：5′-TGGTCCGTGTTTCAAGAC-3′.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，42 ℃退火2 min，72 ℃延伸90 s；95 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，4個(gè)循環(huán)；95 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min.取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序由昆明碩擎生物科技有限公司完成.

運(yùn)用DNAMAN7.0[32]對(duì)所測(cè)序列采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行拼接，隨后通過Bankit軟件編輯，提交NCBI數(shù)據(jù)庫并獲得GenBank登錄號(hào).基于BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)選擇GenBank中同屬物種進(jìn)行序列分析，用MEGA7.0[33-34]計(jì)算序列間轉(zhuǎn)換/顛換值，并基于雙參數(shù)模計(jì)算遺傳距離，以偽錨盤蟲屬(Pseudancylodiscoides)單殖吸蟲作為外群，通過最大似然法(maximum likelihood，ML)、鄰接法(neighbor-joining，NJ)和最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony，MP)構(gòu)建50%合一樹.

2 結(jié) 果

2.1 基于28S rDNA部分序列撒氏蟲屬單殖吸蟲的分類鑒定

目標(biāo)序列的宿主魚、采集地、GenBank登錄號(hào)及長(zhǎng)度等信息見表1.基于雙參數(shù)模的遺傳距離見表2.

經(jīng)測(cè)序獲得目標(biāo)序列873 bp共計(jì)保守位點(diǎn)449個(gè)，變異位點(diǎn)414個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)297個(gè)，自裔位點(diǎn)117個(gè)，平均轉(zhuǎn)換/顛換值R為1.2.A、T、G和C堿基的平均含量分別為23.3%、27.9%、28.1%和20.6%.

牛欄江撒氏蟲與GenBank中21種撒氏蟲屬單殖吸蟲的同源性序列平均相似度在83.48%～92.48%之間，其中與大莖撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH213065)的相似度最高為92.48%，基于雙參數(shù)模遺傳距離的范圍為0.080～0.341，該種吸蟲與大莖撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH213065)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate MG-2018)和撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.NY1)的遺傳距離最近，為0.080(見表2)，三者的56個(gè)堿基存在差異，差異值為6.4%(56/873)；撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate G1-6)與上述21種撒氏蟲屬單殖吸蟲的同源性序列平均相似度在83.64%～99.74%之間，其中與奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：DQ157668)的相似度最高為99.74%，基于雙參數(shù)模遺傳距離的范圍為0.005～0.285，該種吸蟲與奇異撒氏蟲的遺傳距離最近，為0.005(見表2)，二者的68個(gè)堿基存在差異，差異值為8.0%(68/857)；撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate I3-1)與上述21種撒氏蟲屬單殖吸蟲的同源性序列平均相似度在85.51%～99.14%之間，其中與奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH094192)的相似度最高為99.14%，基于雙參數(shù)模遺傳距離的范圍為0.005～0.285，該種吸蟲與奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH094192)的遺傳距離最近，為0.004(見表2)，二者的61個(gè)堿基存在差異，差異值為7.2%(61/847).

牛欄江撒氏蟲與大莖撒氏蟲、弓陰撒氏蟲相似，三者支持器均為槽狀，但弓陰撒氏蟲末端中空膨大呈Ω狀，大莖撒氏蟲與牛欄江撒氏蟲末端彎曲處均具一突起和一環(huán)形小孔，但前者末端有多個(gè)三角突起，而后者于突起對(duì)立面伸出一柄狀結(jié)構(gòu).系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該種吸蟲單獨(dú)成支(圖3 Clade 6)，且支持率分別為86%、78%和54%，綜合形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，認(rèn)為該種為科學(xué)上1新種；撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate G1-6)與王建強(qiáng)[19]描述的撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.1)相似，但二者支持器結(jié)構(gòu)明顯不同，本種支持器簡(jiǎn)單，一字形，末端分化為兩三角形突起，交接管于中央穿過，而后者末端具一小環(huán)，交接管從此穿過.進(jìn)化樹顯示該種吸蟲與奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：DQ157668)聚為一支(圖1 Clade Ⅰ)，但支持率較低，分別為89%、90%和68%，綜合形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，認(rèn)為該種為科學(xué)上1未記錄種；撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate I3-1)與奇異撒氏蟲相似，二者支持器末端均有一不規(guī)則長(zhǎng)舌狀物，但本種支持器距末端1/3處彎曲，長(zhǎng)舌狀物與彎曲凸面同向，而后者支持器末端具多個(gè)突起.除此之外，本種陰道結(jié)構(gòu)呈胃腸狀，由一段短的狹管和一相互折疊的寬管組成，后者呈臘腸狀.進(jìn)化樹顯示該種吸蟲與本研究奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH094192)聚為一支(圖3Clade 2)，但支持率低，分別為58%、51%和61%，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，認(rèn)為該種為科學(xué)上1未記錄種.

2.2 基于28S rDNA部分序列撒氏蟲屬單殖吸蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育研究

基于28S rDNA部分序列，利用MEGA7.0構(gòu)建的以NJ樹為基礎(chǔ)的NJ/ML/MP 50%合一樹顯示(圖1)，撒氏蟲屬為非單系群.本研究22種撒氏蟲聚為Clade Ⅰ和Clade Ⅱ兩個(gè)大的進(jìn)化支.Clade Ⅰ包括本研究撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate G1-6)和來自重慶的2種撒氏蟲：奇異撒氏蟲(T.varicus)(GenBank登錄號(hào)：DQ157668)、筒鞘撒氏蟲(T.infundibulovagina).Clade Ⅱ由Clade 1、Clade 2、Clade 3、Clade 4、Clade 5及Clade 6共六個(gè)進(jìn)化支構(gòu)成，其中，由Clade 1、Clade 2和Clade 3組成的進(jìn)化支中8種撒氏蟲包括本研究4種撒氏蟲：變形撒氏蟲、奇異撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH094192)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate I3-1)和多形撒氏蟲 (GenBank登錄號(hào)：MK353164)，來自廣東的4種撒氏蟲：多形撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：EF100550)、弓陰撒氏蟲(T.omegavagina)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.2 XW-2007)、螺鞘撒氏蟲(T.cochleavagina)；Clade 4包括本研究?jī)磹喝鍪舷x(GenBank登錄號(hào)：MG601545)與來自重慶的2種撒氏蟲：兇惡撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：DQ157669)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.NY2)；Clade 5包括來自捷克的2種撒氏蟲：T.siluri與T.vistulensis；Clade 6包括本研究3種撒氏蟲：牛欄江撒氏蟲、大莖撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：MH213065)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate MG-2018)和來自重慶的2種撒氏蟲：撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.1 XW-2007)、撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.NY1)，以及來自廣東的大莖撒氏蟲(GenBank登錄號(hào)：EF100549).

表1 撒氏蟲屬單殖吸蟲宿主、GenBank登錄號(hào)、長(zhǎng)度及采集地Table 1 Information of Thaparocleidus species,including host,accession number of GenBank,localities and length

*表示本研究所獲得的基因登錄號(hào)

表2撒氏蟲屬單殖吸蟲28S rDNA部分序列基于雙參數(shù)模的遺傳距離
Table 2 The genetic distance based on Kimura-two-parameter ofThaparocleidusmonogenean species based on 28S rDNA partial sequence

123456789101112131415161718192021222310.0180.0170.0130.0170.0110.0160.0170.0110.0130.0130.0130.0110.0110.0120.0140.0160.0160.0160.0170.0180.0180.02720.1820.0150.0130.0150.0130.0160.0160.0130.0130.0130.0140.0130.0130.0140.0140.0160.0150.0150.0160.0000.0030.02430.1680.1390.0130.0020.0120.0050.0080.0120.0130.0130.0120.0120.0120.0120.0110.0040.0030.0040.0080.0150.0160.02440.1220.1080.1080.0130.0090.0130.0130.0090.0000.0000.0090.0090.0090.0100.0090.0120.0130.0130.0130.0130.0140.02350.1700.1350.0040.1030.0120.0050.0080.0120.0130.0130.0120.0120.0120.0120.0120.0040.0020.0040.0080.0150.0160.02360.0800.1060.0960.0550.0940.0120.0130.0000.0090.0090.0080.0000.0010.0050.0080.0120.0120.0120.0130.0130.0140.02370.1700.1440.0180.1060.0170.0960.0080.0120.0130.0130.0120.0120.0120.0120.0120.0030.0050.0040.0090.0160.0160.02480.1740.1500.0410.1150.0400.1030.0450.0130.0130.0130.0130.0130.0130.0120.0130.0080.0070.0080.0050.0160.0160.02490.0800.1060.0960.0550.0940.0000.0960.1030.0090.0090.0080.0000.0010.0050.0080.0120.0120.0120.0130.0130.0140.023100.1220.1080.1080.0000.1030.0550.1060.1150.0550.0000.0090.0090.0090.0100.0090.0120.0130.0130.0130.0130.0140.023110.1220.1080.1080.0000.1030.0550.1060.1150.0550.0000.0090.0090.0090.0100.0090.0120.0130.0130.0130.0130.0140.023120.1160.1130.0920.0580.0910.0420.0920.1030.0420.0580.0580.0080.0080.0090.0040.0110.0120.0120.0130.0140.0140.022130.0800.1060.0960.0550.0940.0000.0960.1030.0000.0550.0550.0420.0010.0050.0080.0120.0120.0120.0130.0130.0140.023140.0820.1040.0940.0530.0920.0010.0940.1010.0010.0530.0530.0430.0010.0050.0080.0120.0110.0120.0130.0130.0130.023150.0970.1100.0920.0590.0890.0200.0960.1010.0200.0590.0590.0500.0200.0210.0090.0120.0110.0120.0120.0140.0140.022160.1210.1140.0870.0620.0860.0460.0940.1010.0460.0620.0620.0140.0460.0480.0530.0120.0120.0120.0130.0140.0140.023170.1670.1390.0140.1010.0120.0910.0040.0400.0910.1010.1010.0870.0910.0890.0910.0890.0040.0030.0080.0160.0160.024180.1680.1370.0040.1050.0030.0910.0170.0400.0910.1050.1050.0910.0910.0890.0870.0860.0120.0040.0080.0150.0160.024190.1680.1390.0110.1060.0090.0920.0120.0400.0920.1060.1060.0890.0920.0910.0920.0890.0080.0090.0080.0150.0160.024200.1700.1440.0430.1120.0380.1030.0460.0150.1030.1120.1120.1030.1030.1010.0990.0990.0420.0420.0420.0160.0160.024210.1820.0050.1390.1080.1350.1060.1440.1500.1060.1080.1080.1130.1060.1040.1100.1140.1390.1370.1390.1440.0030.024220.1820.0040.1410.1120.1370.1060.1460.1520.1060.1120.1120.1140.1060.1040.1120.1140.1410.1390.1410.1460.0040.024230.3410.2850.2890.2750.2820.2610.2870.2940.2610.2750.2750.2630.2610.2610.2520.2680.2870.2820.2890.2850.2850.2850.027

對(duì)角線以下為遺傳距離，對(duì)角線以上為標(biāo)準(zhǔn)差，物種順序如表1

3 討論與小結(jié)

基于28S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，撒氏蟲屬為非單系群.撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate G1-6)與筒鞘撒氏蟲和奇異撒氏蟲(GenBank 登錄號(hào)：DQ157668)聚為Clade Ⅰ，其余蟲種(除T.siluri、T.vistulensis寄生于S.glanis外均寄生于鯰魚S.asotus)均聚為Clade Ⅱ；其中奇異撒氏蟲(GenBank 登錄號(hào):DQ157668)與撒氏蟲屬未定種(Thaparocleidussp.isolate G1-6)組成的進(jìn)化支位于系統(tǒng)樹的基部，推測(cè)在所有采用的22種撒氏蟲屬單殖吸蟲中，奇異撒氏蟲進(jìn)化地位較原始.

吳相云等[11,20]依據(jù)雄性交接器的形態(tài)學(xué)特征，將14種撒氏蟲分為4個(gè)類群，其中前三個(gè)類群分別對(duì)應(yīng)于本研究的Clade Ⅰ、由Clade 1、Clade 2和Clade 3組成的進(jìn)化支以及由Clade 4、Clade 5和Clade 6組成的進(jìn)化支.其中，由Clade 1、Clade 2和Clade 3組成的進(jìn)化支中8種撒氏蟲的主要特征為支持器大型，末端具復(fù)雜幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，交接管基部呈瓶狀.由Clade 4、Clade 5和Clade 6組成的進(jìn)化支中11種撒氏蟲的交接器具相似的特征：支持器槽狀，末端彎曲且具一環(huán)形小孔，交接管由此穿過.與吳相云等的研究結(jié)果出現(xiàn)分歧的是筒鞘撒氏蟲和奇異撒氏蟲的分類地位，在其研究中，因交接器明顯小于其他撒氏蟲、支持器末端具一突起、交接管極細(xì)等特征，筒鞘撒氏蟲單獨(dú)占一個(gè)Clade，而奇異撒氏蟲則聚于本研究由Clade 1、Clade 2和Clade 3組成的進(jìn)化支中，但在本研究中兩者聚為一支(Clade Ⅰ).本研究與Verma等[2,33]的結(jié)果一致，推測(cè)出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是兩種撒氏蟲的28S rDNA分子序列堿基相似性較高，兩者的遺傳距離僅為0.004(表2)，驗(yàn)證了imková等[28]的結(jié)論：形態(tài)學(xué)差異較大的撒氏蟲卻顯示較低的分子差異.且二者分布地均在重慶市榮昌區(qū)，可能符合單殖吸蟲物種形成中的同域物種形成.

-表示置信度<50%圖1 基于28S rDNA部分序列，撒氏蟲屬單殖吸蟲以NJ樹為基礎(chǔ)的NJ/ML/MP 50%合一樹Fig.1 The consensus tree of NJ/ML/MP analysis based on NJ tree topology constructed from 28S rDNA partial sequence of Thaparocleidus monogenean species

目前我國有關(guān)撒氏蟲屬的研究還較少，該屬內(nèi)單殖吸蟲的同物異名現(xiàn)象及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，如是否為單系群、與其他屬中相似種的親緣關(guān)系等均有待進(jìn)一步的深入研究.隨著更多的物種和分類單元被發(fā)現(xiàn)，種間變異和種內(nèi)變異的形態(tài)學(xué)特征被不斷揭示，形態(tài)分類學(xué)方法存在一定的局限性和不足.分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于種間鑒定和種間親緣關(guān)系的研究中，DNA序列分析能在小范圍內(nèi)有效解決由于形態(tài)特征缺失或用形態(tài)分類學(xué)方法無法客觀辨別的某些種類的分類地位問題，從基因型的角度補(bǔ)充或修正了一些形態(tài)分類學(xué)的不足，糾正以往分類上的偏差.但目前數(shù)據(jù)庫中魚類單殖吸蟲的分子系統(tǒng)研究數(shù)據(jù)非常有限，因此，后續(xù)開展單殖吸蟲的分子標(biāo)記和分子系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)，選擇適合各類群的靶基因或開展線粒體全基因組的研究，將極大程度上完善單殖吸蟲分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究.

致謝：衷心感謝中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所楊君興研究員、潘曉賦副研究員和云南水投—滇池補(bǔ)水工程公司德澤樞紐管理部魚類增殖流放站楊世論老師在宿主樣品采集和鑒定方面給予的幫助.