玉米肽對乙醇氧化損傷模型小鼠的抗氧化作用研究

李雍，林峰，秦勇，劉偉，周雅琳，李?，B，于蘭蘭，許雅君，4，

（1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；3.正生營養(yǎng)研究院，新疆 昌吉 830000；4.食品安全毒理學(xué)研究與評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

近年來隨著我國酒類產(chǎn)量的不斷增加，飲酒率及酒精性肝病的發(fā)病率也在逐年增長[1]，而酒精的過量攝入及長期低劑量攝入對人類身體健康都有極大危害。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是指由于長期大量攝入酒精而導(dǎo)致肝臟損害的一系列病變[2]。該病主要由促進(jìn)脂肪變性過程的酒精代謝副產(chǎn)物驅(qū)動，可導(dǎo)致脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌[3]?，F(xiàn)今，臨床上的很多治療肝損傷的藥物所帶來的毒副作用不容回避，而充分利用天然植物資源，開發(fā)具有保肝作用的植物資源，可以為新型保肝藥提供理論基礎(chǔ)。

我國玉米資源豐富，生產(chǎn)淀粉一直以來都是其最大的商業(yè)開發(fā)途徑，而生產(chǎn)所得副產(chǎn)物——玉米麩質(zhì)粉中醇溶蛋白的高憎水性，限制了它在食品中的廣泛應(yīng)用[4]，而將玉米蛋白水解制成的玉米肽當(dāng)前已被證明有著抗氧化、醒酒、降低血清中膽固醇濃度等多種保健食品的優(yōu)良特性，本研究采用新疆地區(qū)特有的粉質(zhì)型玉米品種，立足于該地區(qū)特色植物多肽的功效研究，著力為開發(fā)其特色玉米品種的保健應(yīng)用提供新思路，為該拓寬地區(qū)特色玉米的商業(yè)用途提供理論基礎(chǔ)的同時，也為保肝護(hù)肝藥資源的開發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)的天然植物資源，拉動了新疆地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展并促進(jìn)該地區(qū)維穩(wěn)工作的進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米肽以玉米黃粉為加工原料，經(jīng)蛋白分離純化、酶解、純化、干燥等步驟獲得。其相對分子質(zhì)量＜1 000 D，由2～6 個氨基酸構(gòu)成，可不經(jīng)消化，直接吸收供組織利用。凝膠色譜圖見圖1。

圖1 玉米肽凝膠色譜圖Fig.1 Corn peptide gel chromatogram

酪蛋白（Sigma C5890）：Sigma 公司。

健康成年SPF 級ICR 雄性小鼠50 只，使用許可證號：SCXX（京）2016-0010，體質(zhì)量（25.0±5.0）g；受試動物由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，動物飼喂于屏障環(huán)境中。環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度50%～60%，明暗交替 12 h ∶12 h。

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒、蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PC）測試盒、蛋白定量測試盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140 電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；FLUO star Omega 多功能酶標(biāo)儀：BMG LABTECH Inc.；BFX5-320 型低溫自動平衡離心機(jī)：白洋離心機(jī)廠；Allegra X-30R 臺式高速冷凍離心機(jī)：BECKMAN COULTERTM；HH·S11-1 電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

50 只雄性ICR 小鼠經(jīng)1 周適應(yīng)期后，稱重并按體重隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、模型組、玉米肽低、中和高劑量組，每組各10 只。各組均給予維持飼料，自由進(jìn)食、飲用無菌去離子水。

1.3.2 造模及給藥

實(shí)驗(yàn)期間每天早上 8：00～10：00 對小鼠灌胃，對各劑量組灌胃給藥不同劑量受試樣品，其中低劑量組：0.4 g（/kg·bw）、中劑量組：0.8 g（/kg·bw）、高劑量組：1.6 g（/kg·bw），對照組和模型組給予等體積的酪蛋白1.6 g（/kg·bw），以灌胃容量0.1 mL/10 g 連續(xù)灌胃30 d，并根據(jù)體質(zhì)量來調(diào)整灌胃劑量，灌胃期間自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)時間30 d。間隔5 d 稱重并記錄其體重與攝食量。末次灌胃后除對照組外，其他4 組禁食16 h，然后一次性經(jīng)口灌胃給予50%乙醇12 mL（/kg·bw）。

1.3.3 測試樣品制備及指標(biāo)檢測

模型對照組和實(shí)驗(yàn)組灌胃乙醇6 h 后，摘眼球取血處死，血液分全血和血清兩部分進(jìn)行收集，其中一部分采用0.5 mL 離心管收集，3 000 r/min 離心10 min，取上清液備用（用于檢測血液T-SOD 和丙二醛含量），另一部分用1.5 mL 抗凝管收集全血備用（用于檢測血液 GSH-Px 和 GSH 含量）。

解剖小鼠取肝臟并準(zhǔn)確稱取4 份0.1 g 的肝臟組織，其中3 份加入9 倍體積的生理鹽水（用于測肝臟GSH、T-SOD、GSH-Px、MDA），另外一份加入蛋白質(zhì)羰基含量測試盒試劑一（用于測肝臟蛋白質(zhì)羰基含量），制成10%的組織勻漿液后，2 500 r/min 離心10 min，取上清液備用。最后對小鼠的肝組織及血液中的指標(biāo)采用測試盒說明書要求進(jìn)行統(tǒng)一測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為連續(xù)變量，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異利用單因素方差分析（one-way ANOVA）處理，以p ＜0.05 作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）在方差齊時進(jìn)行兩兩比較；采用Tamhane’s 法在方差不齊時進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽對小鼠體重及食物利用率的影響

實(shí)驗(yàn)動物體重在實(shí)驗(yàn)開始時均無顯著性差異（p＞0.05）。其體重及食物利用率在各組的變化結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 玉米肽對小鼠體重的影響Fig.2 The effect of corn peptide on the weight of mice

圖3 玉米肽對小鼠食物利用率的影響Fig.3 Effect of corn peptide on the utilization rate of food in mice

由圖2、圖3可得，小鼠的體重隨著時間的延長而增長，各組的食物利用率及凈增體重?zé)o顯著性差異（p＞0.05），各組動物在實(shí)驗(yàn)過程中無表現(xiàn)異常，這說明玉米肽在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對小鼠正常生長無影響，玉米肽對動物的生長發(fā)育無不良影響。

2.2 玉米肽對小鼠抗氧化物質(zhì)GSH含量的影響

小鼠體內(nèi)全血和肝臟抗氧化物質(zhì)GSH 含量結(jié)果如表1所示。

表1 玉米肽對小鼠抗氧化物質(zhì)GSH 的影響（±SD，n=10）Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH（±SD，n=10）

表1 玉米肽對小鼠抗氧化物質(zhì)GSH 的影響（±SD，n=10）Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別全血/（g/L）肝臟/（mg/gprot）空白對照組 0.23±0.04 1.42±0.35模型對照組 0.19±0.04# 0.71±0.07#玉米肽低劑量組 0.23±0.04* 0.77±0.08玉米肽中劑量組 0.23±0.04* 1.00±0.24*玉米肽高劑量組 0.22±0.025** 1.25±0.23

模型組全血和肝臟中GSH 的含量顯著低于空白對照組（p＜0.05）；全血中的GSH 含量在各劑量組中均較之模型組顯著提升（p＜0.05），同時中劑量組肝組織的GSH 含量較之模型組也表現(xiàn)出了顯著上升（p＜0.05）。

2.3 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD活力的影響

小鼠血清和肝組織SOD 含量見表2。

表2 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD（±SD，n=10）

表2 玉米肽對小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響（±SD，n=10）Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；##、**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別血清/（U/mL）肝臟/（U/mgprot）空白對照組 104.32±7.11 248.50±24.57模型對照組 95.52±5.38# 202.80±13.84##玉米肽低劑量組 101.72±2.96 217.40±17.19##玉米肽中劑量組 103.40±4.00* 220.00±11.96##*玉米肽高劑量組 98.97±7.35 231.61±20.56#**

模型組較之空白對照組血清和肝組織中的SOD活性顯著降低（p＜0.05）；而各劑量組與模型組比較，中劑量組在血清SOD 酶活性有顯著提升（p＜0.05），肝臟中SOD 酶活性的顯著提升也在中、高劑量組有所體現(xiàn)（p＜0.05）。

2.4 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影響

小鼠全血和肝組織中GSH-Px 酶含量結(jié)果見表3。

表3 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響（±SD，n=10）Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px（±SD，n=10）

表3 玉米肽對小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響（±SD，n=10）Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px（±SD，n=10）

注：#、*表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.05，差異顯著；##、**表示較之正常對照組/模型對照組p＜0.01，差異極顯著。

肝臟/（U/mgprot）空白對照組 573.70±43.53 584.68±35.13模型對照組 444.65±46.41## 420.32±25.81##玉米肽低劑量組 526.04±38.41#** 461.87±56.52##玉米肽中劑量組 607.74±28.88** 467.40±66.09##*玉米肽高劑量組 594.39±48.61** 563.16±67.10**組別 全血/（U/mL）

較之正常對照組，模型對照組全血和肝組織中的GSH-Px 活性顯著降低（p＜0.01）；全血中各劑量組提升GSH-Px 酶活性效果顯著（p＜0.01），而肝臟中玉米肽中、高劑量組也表現(xiàn)出了顯著的差異（p＜0.05）。

2.5 玉米肽對小鼠過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物MDA含量的影響

小鼠血清和肝臟組織中的MDA 含量結(jié)果見表4。

模型組肝組織中MDA 含量較之空白對照組提升顯著（p＜0.01）。高劑量組血清MDA 含量顯著低于模型組（p＜0.05），而肝臟中雖然各劑量組相對于模型組MDA 含量均有減少趨勢，但無顯著差異（p＞0.05）。

表4 玉米肽對小鼠脂質(zhì)過氧化物MDA 含量的影響（±SD，n=10）Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA（±SD，n=10）

表4 玉米肽對小鼠脂質(zhì)過氧化物MDA 含量的影響（±SD，n=10）Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA（±SD，n=10）

注：*表示較之模型對照組p＜0.05，差異顯著；##表示較之正常對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別血清/（nmol/mL）肝臟/（nmol/mgprot）空白對照組 5.05±2.55 2.57±0.56模型對照組 6.68±2.00 6.40±0.64##玉米肽低劑量組 5.95±2.49 6.35±1.47##玉米肽中劑量組 5.19±2.02 6.00±1.69##玉米肽高劑量組 4.40±0.99* 5.59±0.83##

2.6 玉米肽對小鼠肝臟中PC含量的影響

機(jī)體PC 含量可以間接說明玉米肽抗氧化損傷的能力，結(jié)果見表5。

表5 玉米肽對小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響（±SD，n=10）Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl（±SD，n=10）

表5 玉米肽對小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響（±SD，n=10）Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl（±SD，n=10）

注：*表示較之模型對照組p＜0.05，差異顯著；##表示較之正常對照組p＜0.01，差異極顯著。

組別PC/（nmol/mgprot）空白對照組 2.89±0.58模型對照組 5.51±1.16##玉米肽低劑量組 3.72±1.41*玉米肽中劑量組 3.61±1.89*玉米肽高劑量組 3.61±1.40*

較之正常對照組，模型組肝組織中的蛋白質(zhì)羰基含量升高（p＜0.01）。各劑量組肝組織中PC 含量顯著（p＜0.01）低于模型組。

3 討論與結(jié)論

通過脫氫酶代謝乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┖罄^續(xù)代謝成乙酸鹽，導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸產(chǎn)生，脂肪酸氧化抑制和脂肪積累，乙醇代謝后還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的生成增多，會增強(qiáng)呼吸鏈的活動，故氧化應(yīng)激是酒精肝毒性的一個特征，同時也在酒精性肝病的發(fā)展中起重要作用[5]。本研究以小鼠肝臟和血液中的GSH、MDA 含量以及抗氧化酶系SOD、GSH-Px 的活性與肝組織蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PC）含量為檢測指標(biāo)，探究玉米肽對小鼠乙醇氧化損傷模型的抗氧化程度。結(jié)果顯示各指標(biāo)模型組較之空白組均有顯著差異，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功，分析各指標(biāo)可得，非酶類抗氧化劑GSH 和抗氧化酶系SOD 與GSH-Px 均在血清和肝臟中表現(xiàn)出顯著的差異（p＜0.01），此外肝組織PC 在各劑量組中均顯示出了顯著差異（p＜0.05），而MDA 僅在高劑量組血清中有顯著性差異（p＜0.05），肝臟中未有任何顯著性差異（p＞0.05）。

本實(shí)驗(yàn)中的玉米肽平均相對分子質(zhì)量低于1 000 D，由2～6 個氨基酸構(gòu)成，可不經(jīng)消化，直接吸收供組織利用，相關(guān)研究顯示，水解玉米蛋白粉并經(jīng)過正交試驗(yàn)后可獲得抗氧化性大幅提升的玉米肽，其抗氧化活性與其相對分子質(zhì)量具有相關(guān)性。DPPH 自由基的清除能力與其分子量顯著相關(guān)，相對分子質(zhì)量在5 000 D以下，隨著相對分子質(zhì)量的上升而下降[6]。結(jié)果表明玉米肽對乙醇誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠具有抗氧化作用，這可能是通過提升其體積內(nèi)抗氧化酶系活性、清除體內(nèi)自由基等途徑實(shí)現(xiàn)的。

乙醇誘導(dǎo)肝損傷中的氧化應(yīng)激和自由基損傷作用一直被認(rèn)為是極為重要的途徑[7]。一旦出現(xiàn)促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡，作為氧化代謝的副產(chǎn)物產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）就會損害細(xì)胞大分子，例如DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。研究表明乙醇攝入增加了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA 的形成[7]。為了抵消這種氧化應(yīng)激，細(xì)胞同時具有多種抗氧化酶系，其中主要是SOD 和GSH-Px，是細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時進(jìn)行抵御的重要酶系。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，MDA 含量在小鼠血清中降低顯著（p＜0.05），同時抗氧化酶系SOD 和GSH-Px 在小鼠體內(nèi)均表現(xiàn)出了顯著的活力提升（p＜0.01），這表明玉米肽一方面可以激活體內(nèi)抗氧化酶系，結(jié)合其氧化損傷后的自由基，同時可以通過自身直接結(jié)合自由基，來降低乙醇對肝臟的損害，降低膜脂損害后產(chǎn)生的大量MDA，進(jìn)而在機(jī)體中起到抗氧化的作用。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，GSH 是Nrf2 的靶關(guān)鍵解毒酶，Nrf2 是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，在預(yù)防乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)積聚方面發(fā)揮著重要作用[8]。植物化學(xué)物質(zhì)可以通過直接結(jié)合Keap1 激活Nrf2 共價(jià)連接，誘導(dǎo)解毒酶和相關(guān)蛋白，在保護(hù)細(xì)胞免受ROS 施加的自由基應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[9-10]。據(jù)此可以解釋本實(shí)驗(yàn)中在GSH 含量上顯示的顯著（p＜0.01）提高。除抗氧化酶系和膜脂受損的評價(jià)指標(biāo)外，蛋白質(zhì)作為功能繁多的生物大分子存在于體內(nèi)，也是受到自由基攻擊的主要目標(biāo)，其側(cè)鏈氨基酸的氧化是生命系統(tǒng)的重要信號，蛋白質(zhì)受損的一個重要標(biāo)志也就是蛋白質(zhì)側(cè)鏈羰基的形成。因此蛋白質(zhì)羰基含量的測定是對衡量自由基對機(jī)體的損傷程度有著實(shí)際意義的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)中玉米肽各劑量組均顯著低于空白對照組（p＜0.05），提示玉米肽可以自身結(jié)合自由基，在一定程度上防護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)受自由基損害。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在一定劑量下，由新疆地區(qū)特色粉質(zhì)型玉米所研發(fā)的玉米肽具有抗氧化功能，這為該地區(qū)玉米開發(fā)具有保肝護(hù)肝及抗氧化功能產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)，并拓展了該地區(qū)特色玉米品種的商業(yè)用途。