響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取金紅蘋果多酚工藝研究*

郝 鑫 呂慧威 沈曉溪 孫志波 周曉梅*

1（吉林師范大學博達學院食品工程系，吉林四平136000）2（四平市科學技術(shù)研究院，吉林四平136000）

金紅蘋果，又稱吉紅蘋果、“123”果，薔薇科蘋果屬，是由吉林農(nóng)業(yè)科學研究所于上世紀60年代用優(yōu)質(zhì)大蘋果“金冠”和抗寒小蘋果“紅太平”雜交培育而成。果實汁多，酸甜爽口，營養(yǎng)成分豐富，素有“全方位健康水果”和“全科醫(yī)生”之稱。作為一種早熟品種，它產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)，抗寒力與適應性強，因此是吉林地區(qū)的主要果樹栽培品種。但是隨著交通運輸以及電子商務(wù)的發(fā)達，使得金紅蘋果在鮮果市場的競爭力減弱，造成一定程度的資源浪費。

植物多酚是多羥基酚類化合物的總稱，主要分布在植物體的皮、根、葉、殼和果肉中，尤其是蔬菜、水果、茶等植物，在自然界中的儲量非常豐富。近年來研究人員對植物多酚的功能性進行研究，結(jié)果表明植物多酚在抗氧化、抑菌、抗癌、抗老化等方面均有顯著功效，攝入一定量的植物多酚能夠有效地預防和抑制疾病的發(fā)生。在日本，則有人將植物多酚稱為第七類營養(yǎng)素。因為植物多酚有多種活性作用，使得它成為科研人員研究的熱點、食品添加劑生產(chǎn)廠家熱衷的生產(chǎn)原料。目前越來越多的新型萃取技術(shù)已被應用于多酚的提取，如超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法和加壓液體萃取法等。其中，超聲波提取法應用較廣，因為超聲波在工作時產(chǎn)生機械效應、熱效應及擴散、空化效應、乳化效應、擊碎效應、化學效應等，這些作用結(jié)果能夠使細胞壁破碎速度增加，有效促進細胞外部溶劑進入細胞內(nèi)部，使細胞中有效成分溶出，縮短作用時間，從而提高效率。

本次試驗是在齊娜、王臨賓、辛明亮、郭嬌嬌等研究的基礎(chǔ)上，以金紅小蘋果為原料，利用響應面法，優(yōu)化超聲波輔助提取金紅蘋果多酚的工藝?？疾炝顺暡üβ?、乙醇體積分數(shù)，提取時間、提取溫度和液料比5個因素對提取效果的影響，并得到最佳提取工藝，旨在為提高金紅蘋果利用率方面提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮金紅蘋果，購自四平市某水果超市。

沒食子酸標準品，98%，上海金穗生物科技有限公司；福林酚、碳酸鈉、無水乙醇，均為分析純，上海金穗生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP4002電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；JYL料理機，九陽股份有限公司；GZX鼓風干燥箱，濟南捷島分析儀器有限公司；GF-08高速多功能粉碎機，浙江榮浩工貿(mào)有限公司；SY-1000E多用途恒溫超聲提取機，上海比朗儀器制造有限公司；LXJ-B離心機，上海安亭科學儀器廠；TU-1901紫外分光光度計，北京普希儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 金紅蘋果預處理

將新鮮金紅蘋果清洗后，切塊，去核，進行粗破碎，在60℃的鼓風干燥機中干燥至果肉變酥脆，期間每隔1 h調(diào)整托盤中蘋果塊位置，翻面調(diào)整，保證干燥均勻。將干燥好的金紅蘋果塊研磨至粉末狀，過40目篩網(wǎng)，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標準曲線的制作

稱取標準品（沒食子酸） 1.000 g于1000 mL容量瓶中，蒸餾水溶解后定容。制得的溶液即為沒食子酸標準儲備液。分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL沒食子酸標準儲備液于100 mL容量瓶中并定容。取上述不同質(zhì)量濃度各溶液1 mL，分別加到10 mL容量瓶中，依次各加入5.0 mL10%Folin-Ciocalteau試劑，搖勻后反應5 min～6 min，再依次加入4.0 mL7.5%碳酸鈉溶液，最后用蒸餾水定容，搖勻，常溫靜置1 h。在760 nm處測定標準溶液的吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 金紅蘋果多酚含量的測定

稱取5 g金紅蘋果粉末于250 mL三角瓶中，以乙醇溶液作為提取溶劑，在超聲波輔助下提取，過濾后將濾液定容至250 mL，視為待測樣液。移取1 mL待測樣液于25 mL容量瓶中定容，按上述

1.3.3 方法測定吸光度，計算多酚得率。

1.3.5 多酚提取單因素試驗

為了考察不同因素對金紅蘋果多酚提取效果的影響，選擇超聲功率（W）、乙醇體積分數(shù)（%）、提取時間（min）、提取溫度（℃）、料液比（mL∶g）5種因素進行單因素試驗。

1.3.5.1 超聲波功率對提取得率的影響

在乙醇體積分數(shù) 40%，液料比 30∶1（mL∶g），提取溫度55℃，提取時間30 min的條件下，超聲波功率分別選擇為200 W、300 W、400 W、500 W、600 W，依次考察不同超聲波功率對金紅蘋果多酚提取得率的影響。

1.3.5.2 乙醇體積分數(shù)對提取得率的影響

在超聲波功率 600 W，液料比 30∶1 （mL∶g），提取溫度55℃，提取時間30 min的條件下，乙醇體積分數(shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%，依次考察不同乙醇體積分數(shù)對金紅蘋果多酚提取得率的影響。

1.3.5.3 提取時間對提取得率的影響

在超聲波功率600 W，乙醇體積分數(shù)40%，液料比30∶1（mL∶g），提取溫度55℃條件下，超聲波作用時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，依次考察不同提取時間對金紅蘋果多酚提取得率的影響。

1.3.5.4 提取溫度對提取得率的影響

本研究根據(jù)感知價值理論的相關(guān)文獻，在以前研究者采用的調(diào)查問卷基礎(chǔ)上結(jié)合無現(xiàn)金支付自身的特征，歸納消費者使用無現(xiàn)金支付的影響因素，選擇合適的變量作為問卷設(shè)計的依據(jù)，最后形成了消費者無現(xiàn)金支付使用意愿影響因素量表。量表的所有題項均采用Likert 5級量表，用1-5表示不同意到非常同意5個選項。

在超聲波功率600 W，乙醇體積分數(shù)40%，液料比30∶1（mL∶g），提取時間30 min條件下，提取溫度分別設(shè)置為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，依次考察不同提取溫度對金紅蘋果多酚提取得率的影響。

1.3.5.5 液料比對提取得率的影響

在超聲波功率600 W，乙醇體積分數(shù)40%，提取時間30 min，提取溫度為55℃條件下，液料比分別為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g），依次考察不同液料比對金紅蘋果多酚提取得率的影響。

1.3.6 Box-Behnken響應面法優(yōu)化試驗

通過單因素試驗，在Design Expert8.0.6.1軟件的幫助下，遵照Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇提取時間（min） A、超聲功率（W） B、乙醇體積分數(shù)（%） C、液料比（mL∶g） D 4個變量，以多酚得率為考察指標，設(shè)計響應面試驗（四因素三水平）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線及回歸方程

在最大吸收波長760 nm下，測定不同質(zhì)量濃度（μg/mL） 下沒食子酸標準品溶液的吸光度，標準曲線圖如圖1所示。由圖1可知，沒食子酸質(zhì)量濃度c（μg/mL） -吸光度標準曲線回歸方程為y=10.457x+0.0373，R2=0.9991。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲波功率對金紅蘋果多酚提取得率的影響

圖1 沒食子酸標準曲線

超聲波功率（W）對多酚得率的影響如圖2所示。

圖2 超聲功率對金紅蘋果多酚提取得率的影響

2.2.2 乙醇體積分數(shù)對金紅蘋果多酚提取得率的影響

乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響如圖3所示。結(jié)合數(shù)據(jù)及趨勢圖可看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，多酚得率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，當乙醇體積分數(shù)在20%～40%范圍時，得率是增大趨勢，且增幅較大，體積分數(shù)為40%時，得率達到峰值，當乙醇體積分數(shù)大于40%時，得率下降明顯。出現(xiàn)這種情況，分析原因可能是在乙醇體積分數(shù)大于40%后，醇溶性質(zhì)、色素、親脂性強的成分與乙醇溶液水分子結(jié)合，使得組織的通透性下降、體系的黏度增大，不利于目標物的浸出。因此最終選取體積分數(shù)為40%乙醇溶液作為金紅蘋果多酚的提取溶劑濃度。

圖3 乙醇體積分數(shù)對金紅蘋果多酚得率的影響

2.2.3 提取時間對金紅蘋果多酚提取得率的影響

提取時間（min） 對多酚得率的影響如圖4所示。

圖4 提取時間對金紅蘋果多酚得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，多酚得率的變化分為3種不同情況，即先迅速增加，然后趨于平緩，最后呈下降的趨勢。提取時間由10 min延長到20 min時，可以看出得率增大的趨勢比較明顯。分析原因是提取時間短，對原料細胞壁的破壞作用較小，細胞壁的破壞不徹底，這使得細胞中的多酚物質(zhì)沒有完全溶解在乙醇溶劑中，所以得率較低；而當提取時間延長到20 min時，細胞壁破碎較徹底，多酚物質(zhì)能夠較為徹底的溶出，得率也就有所提高。當繼續(xù)延長提取時間時，多酚物質(zhì)的得率并未有明顯增加，主要原因可能是長時間的作用使得多酚物質(zhì)活性下降或已被氧化。另外考慮到時間、耗能、成本等方面的因素，最終確定了超聲波提取時間為30 min。

2.2.4 提取溫度對金紅蘋果多酚提取得率的影響

提取溫度（℃） 對多酚得率的影響如圖5所示。由圖5可知，不同溫度對金紅蘋果中多酚得率的影響不同，隨溫度的升高多酚得率呈增大趨勢。溫度的升高，有利于超聲波對細胞壁的破壞作用，有利于多酚溶出，提高得率，且溫度升高有助于增大多酚的溶解度，同時多酚的熱穩(wěn)定性比較高，整個溫度范圍內(nèi)，多酚得率持續(xù)增加；溫度越高，耗能越大，升溫時間越長，綜上所述，提取溫度選擇中間溫度55℃為宜。

圖5 提取溫度對金紅蘋果多酚得率的影響

2.2.5 液料比對金紅蘋果多酚提取得率的影響

液料比（mL∶g） 對多酚得率的影響如圖6所示。

圖6 液料比對金紅蘋果多酚得率的影響

由圖6可知，隨著液料比的增大，金紅蘋果多酚的得率呈現(xiàn)先增大，中段平穩(wěn)，末段略有下降趨勢。增大液料比，可使原料與溶劑的接觸面增大，可增加成分溶出，提高得率。當液料比達到30∶1時，多酚得率最高，溶劑用量繼續(xù)增加，得率有所下降。30∶1與35∶1的液料比得到的提取液中多酚的含量相差不明顯，考慮成本及回收的情況，最終選擇液料比為 30∶1。

2.3 超聲波輔助提取金紅蘋果多酚響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗結(jié)果及回歸方程的建立

在單因素試驗研究的基礎(chǔ)上，選擇提取時間（A）、超聲波功率（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、液料比（D）進行四因素三水平的優(yōu)化設(shè)計，響應面因素水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2。

結(jié)合對響應面優(yōu)化設(shè)計得出的數(shù)據(jù)（表2） 進行分析，得金紅蘋果中多酚物質(zhì)與超聲波輔助提取各因素變量間的函數(shù)關(guān)系，所得的二次多項式方程為：Y=5.19+0.29A+0.41B+0.19C+0.95D+0.23AB-0.03AC+0.25AD+0.02BC+0.00BD+0.03CD-0.62A2-0.33B2-0.45C2-0.90D2。回歸方程顯著性檢驗結(jié)果見下頁表3。

表1 超聲波輔助提取金紅蘋果多酚響應面分析因素與水平設(shè)計

表2 超聲波輔助提取金紅蘋果多酚響應面設(shè)計與結(jié)果

由表3可知，回歸模型p＜0.0001，說明二次回歸方程模型差異極顯著。模型整體方差分析F＝9.202，p＜0.05，說明模型成立有統(tǒng)計學意義。失擬合項方差分析表明，F(xiàn)＝5.39，p＞0.05，失擬不顯著，模型決定系數(shù)為0.902，說明響應值的變化90.2%來源于所選因素，說明模型擬合良好，試驗誤差較小，可以用此模型對金紅蘋果多酚的提取工藝進行分析并預測超聲波輔助提取金紅蘋果多酚的最佳工藝參數(shù)。

2.3.2 響應面模型分析因子間交互作用

模型一次項B、D和二次項A2、D2高度顯著，一次項A和二次項C2顯著。

圖7（a）-（f）為試驗各因素對多酚得率影響的響應面圖。其中（a）、（c）、（e）、（f）曲面相對較陡，表明超聲波功率與提取時間、提取時間與液料比、超聲波功率與液料比、乙醇體積分數(shù)與液料比之間的交互作用比較大，它們的作用對多酚得率有一定影響，但是不顯著；（b）、（d） 曲面相對平坦，說明提取時間與乙醇體積分數(shù)、超聲波功率與乙醇體積分數(shù)交互作用小，它們對多酚提取的得率影響小。從圖7整體來看，液料比與其他因素的交互作用對金紅蘋果多酚的影響最顯著。通過對回歸系數(shù)檢驗可知，各因素對多酚得率的影響順序為液料比＞提取時間＞超聲波功率＞乙醇體積分數(shù)。

2.3.3 最佳工藝條件的確定及驗證

通過Design Expert8.0.6.1對回歸方程的分析，得到超聲波輔助提取金紅蘋果多酚的最佳工藝條件為：提取時間34.98 min，超聲波功率581.64 W，乙醇體積分數(shù)42.36%、液料比33.02∶1。根據(jù)以上條件，調(diào)整工藝參數(shù)為提取時間為35 min，超聲波功率為580 W，乙醇體積分數(shù)為40%、液料比（mL/g） 為30∶1。根據(jù)調(diào)整后的工藝參數(shù)，進行3次重復試驗，金紅蘋果多酚的最終得率為5.38%，此結(jié)果與預測的多酚得率5.74%接近，表明回歸模型可以較好的反應金紅蘋果多酚提取的最佳條件。

3 結(jié)論

本試驗研究金紅蘋果多酚的提取工藝優(yōu)化，將超聲波提取的方法應用到乙醇溶劑提取工藝中。首先通過單因素試驗方法確定了提取金紅蘋果多酚物質(zhì)工藝中超聲功率、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比這5種因素對多酚提取得率的影響；然后應用Box-Behnken響應面法建立二次回歸模型方程，對提取的工藝條件進行優(yōu)化，對不同因素及因素的相互作用進行分析，得到最佳工藝條件為：提取時間35 min，超聲波功率580 W，乙醇體積分數(shù)40%，液料比（mL∶g） 30∶1。此條件下金紅蘋果多酚的得率為5.38%。超聲波輔助提取金紅蘋果多酚，工藝時間短，效率高，操作便捷，成本低，對金紅蘋果多酚的提取提供了理論依據(jù)和參考。通過文獻發(fā)現(xiàn)，目前對于蘋果多酚的提取工藝還包括微波輔助、超聲波-微波結(jié)合輔助的方法，為此，將進一步考察微波作用對金紅蘋果多酚物質(zhì)提取的影響。

表3 超聲波輔助提取金紅蘋果多酚回歸方程的方差分析

圖7 試驗各因素對多酚得率影響的響應面圖