紫蘇發(fā)酵乳體外抗氧化活性的研究

田海娟，羅佳 ，孫宇，張傳智 ，潘艷，張艷

（1.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春1300507；2.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長春 130507）

0 引 言

紫蘇(Perilla frutescens(L.)Britt，我國研究紫蘇已有20多年的歷史，紫蘇籽提油后的紫蘇餅粕中含有豐富的活性成分，如α-亞麻酸、亞油酸、油酸、蛋白質(zhì)及氨基酸[1]，另外還含有膳食纖維、谷維素、維生素F、維生素B1、甾醇、磷脂等。目前紫蘇籽粕主要用作飼料，對(duì)紫蘇籽粕中營養(yǎng)成分的利用率較低，造成了浪費(fèi)。開菲爾(Kefir)是一種以牛乳或羊乳為原料，利用開菲爾粒發(fā)酵制得的復(fù)合型發(fā)酵乳。其軍種為Kefir顆粒，是一個(gè)復(fù)雜的微生物共生體系，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的某些屬種組成[2]。開菲爾發(fā)酵乳具有緩解乳糖不耐癥、調(diào)節(jié)胃腸道功能、刺激免疫系統(tǒng)和加速膽固醇代謝等功效[3]。開菲爾有很多潛在功效，為今天備受青睞的健康食品開發(fā)提供新的思路。用開菲爾菌加工紫蘇籽粕發(fā)酵乳，可以得到效用更高，且具有紫蘇特有香味的風(fēng)味發(fā)酵乳。

目前，對(duì)紫蘇抗氧化性的相關(guān)研究很多，但大多集中在其根、莖、葉中[4-7]。從自由基這方面來研究食物的營養(yǎng)與食療效用，具備重要的理論意義和普遍的應(yīng)用價(jià)值。羥基自由基（·OH）是活性氧中最活潑的自由基之一，對(duì)人體的毒性相當(dāng)大，可以直接損傷各種生物膜，使得多種疾病并發(fā)，從而危及生物體[8]。DPPH（分子式C12H12N6O6，Mr=394.32）自由基是一種人工合成的有機(jī)自由基，性質(zhì)穩(wěn)定。其乙醇溶液呈深紫色，并在515～520 nm有最大吸收峰。在DPPH溶液中加入自由基清除劑，深紫色溶液褪成黃色，其褪色程度與自由基所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此能夠通過溶液吸光度的變化來進(jìn)行定量分析[9]。試驗(yàn)以提油后的紫蘇籽粕為原料，經(jīng)低溫超微粉碎，用開菲爾菌作為發(fā)酵劑，制備紫蘇發(fā)酵乳，以·OH清除率、DPPH自由基清除率為指標(biāo)，研究紫蘇發(fā)酵乳體外抗氧化活性的規(guī)律，為高效利用紫蘇籽粕，開發(fā)品質(zhì)穩(wěn)定性較高的紫蘇健康食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫蘇籽：洮南市百群食品科技有限公司；純牛奶：廣澤乳業(yè)有限公司；纖維素酶：河南祥盛食品配料有限公司；開菲爾菌：北京川秀科技有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠，分析純；硫酸亞鐵：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純；過氧化氫：開原化學(xué)試劑一廠，分析純；水楊酸：天津市華東試劑廠，分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

4A220-50-06超臨界萃取裝置，江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；SQW-601三清超微粉碎機(jī)，濟(jì)南易辰超微粉碎技術(shù)有限公司；LBJ-625A食品粉碎器，廣東洛貝電子科技有限公司；HH-2K4二列四孔水浴，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Agilent Cary 60 UV-Vis紫外-可見分光光度計(jì)，美國安捷倫科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 開菲爾菌擴(kuò)大培養(yǎng)

用蒸餾水沖洗開菲爾菌，至其潔凈，置于玻璃杯中，向其中倒入純牛奶，漫過菌種，蓋上紗布，套上橡皮筋，置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 原料預(yù)處理

紫蘇籽經(jīng)超臨界CO2技術(shù)（壓力：25 MPa，溫度：40℃，流量：20 L/h，1 L萃取釜萃取90 min）萃取紫蘇籽油，剩下的紫蘇籽粕經(jīng)超微粉碎處理，冷凍保藏。將適量紫蘇粕置于粉碎器中粉碎，然后過80目篩，冷藏。在燒杯中加入20 g紫蘇籽粕，再用200 g水將其溶解，并添加一定量的纖維素酶，攪拌均勻，置于60℃水浴鍋中酶解。3 h后取出，靜置。

1.2.3 單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取一定量的紫蘇酶解液，再加入開菲爾菌、蔗糖，加牛奶至50 mL，攪拌均勻，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，取出后將發(fā)酵乳過濾，回收開菲爾菌、重復(fù)利用。控制蔗糖添加量為12%，酶解液含量為25%，培養(yǎng)時(shí)間12 h，開菲爾菌接種量分別設(shè)為4%、6%、8%、10%、12%，培養(yǎng)紫蘇發(fā)酵乳?？刂崎_菲爾菌接種量為8%，酶解液含量為25%，培養(yǎng)時(shí)間12 h，蔗糖添加量分別為8%、10%、12%、14%、16%，培養(yǎng)紫蘇發(fā)酵乳?？刂崎_菲爾菌接種量為8%，蔗糖添加量為12%，培養(yǎng)時(shí)間12 h，酶解液含量分別為15%、20%、25%、30%、35%，培養(yǎng)紫蘇發(fā)酵乳。控制開菲爾菌接種量為8%，蔗糖添加量為12%，酶解液含量為25%，培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)為8 h、10 h、12 h、14 h、16 h，培養(yǎng)紫蘇發(fā)酵乳。由于各因素條件在實(shí)際發(fā)酵酸奶時(shí)會(huì)相互影響，所以根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)確定紫蘇發(fā)酵乳體外抗氧化活性的最佳工藝組合。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定

（1）羥基自由基清除率的測(cè)定。

稱取0.1668 g七水硫酸亞鐵顆粒，用蒸餾水定容至100 mL，得到濃度為6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液；量取30%的過氧化氫0.06 mL加水配制成100 mL的6 mmol/L的雙氧水溶液；稱取0.0829 g水楊酸用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得到6 mmol/L的水楊酸溶液。

參考彭惠惠[10]等人的方法，在1.5 mL離心管中依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液300μL、紫蘇發(fā)酵乳樣品300μL、6 mmol/L過氧化氫溶液300μL，搖勻，靜置10 min后再加入6 mmol/L水楊酸溶液300μL，搖勻，靜置30 min，然后在510 nm波長下測(cè)其吸光度。做平行試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

式中：A0為不加發(fā)酵乳樣品液的本底吸光度；AS為加入發(fā)酵乳樣品液反應(yīng)后的吸光度；Ax為不加水楊酸溶液的吸光度。

（2）DPPH自由基清除率的測(cè)定[11]。

準(zhǔn)確稱取0.8 mg DPPH，用無水乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液在517 nm下具有最大的紫外吸收峰，測(cè)定加入紫蘇發(fā)酵乳樣品后A517 nm吸收的下降表示其清除DPPH自由基的能力。

取400μL的發(fā)酵乳樣品于1.5 mL離心管中，再加入2×10-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液400μL，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，然后測(cè)定波長517 nm處的吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定400μL發(fā)酵乳樣品液+400μL無水乙醇混合后的吸光度Ai和400μL DPPH無水乙醇溶液+400μL無水乙醇的吸光度A0。做平行試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

圖表中數(shù)據(jù)為三次平行試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的平均值，誤差為標(biāo)準(zhǔn)偏差。所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件進(jìn)行計(jì)算、制圖整理，用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇粕發(fā)酵乳單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 開菲爾菌接種量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

圖1 接種量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

由圖1可得，未接種開菲爾菌的紫蘇發(fā)酵乳與開菲爾菌接種量為4%的紫蘇發(fā)酵乳的羥基自由基清除率相差不大，DPPH自由基清除率也相差不大。接種后，隨著接種量的增加，發(fā)酵乳的·OH清除率和DPPH自由基清除率均急劇提高再降低。當(dāng)開菲爾菌接種量為10%時(shí)，·OH清除率最高，為（95.31±25.96）%；當(dāng)開菲爾菌接種量為8%時(shí)，紫蘇發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率最高，為（89.47±5.16）%。推測(cè)可能是因?yàn)樽咸K發(fā)酵乳中接入的開菲爾菌對(duì)其抗氧化性有協(xié)同提高作用。試驗(yàn)選取開菲爾菌接種量6%、8%和10%作為正交試驗(yàn)中該因素的3個(gè)水平。

2.1.2 加糖量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

圖2 加糖量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

蔗糖具有還原性可被氧化，具有一定的抗氧化能力，所以選取該因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。由圖2可得，試驗(yàn)制備的發(fā)酵乳用開菲爾作為發(fā)酵劑，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸而導(dǎo)致產(chǎn)品口感過于酸，課題組經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確定了加糖量的適宜范圍為10%左右，為進(jìn)一步研究加糖量對(duì)發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響，單因素?cái)U(kuò)大了加糖量的范圍至16%。隨著加糖量的增多，紫蘇發(fā)酵乳的·OH清除率急劇增大又減小，當(dāng)加糖量為12%時(shí)，·OH清除率最高：（95.52±2.53）%，加糖量從12%增至14%時(shí)，·OH清除率迅速降低，加糖量增至16%時(shí)，與加糖量為14%時(shí)相比略有提高，但相差不大；隨著加糖量的增多，紫蘇發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率迅速增大又漸趨平緩，加糖量為14%時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為（71.79±3.16）%。所以猜測(cè)，加糖量較多時(shí)可以提高紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化性。試驗(yàn)選取加糖量12%、14%和16%作為正交試驗(yàn)中該因素的3個(gè)水平。

2.1.3 酶解液含量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

圖3 酶解液含量對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

由圖3可得，隨著發(fā)酵乳中紫蘇酶解液含量的增加，紫蘇發(fā)酵乳的·OH清除率急劇增大又迅速減小，當(dāng)紫蘇酶解液含量為25%時(shí)，·OH清除率最高，為（90.94±0.26）%；酶解液的含量從15%升到20%時(shí)，紫蘇發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率迅速提高了將近35%，之后隨著酶解液含量的增加，DPPH清除率逐漸提高再降低，當(dāng)紫蘇酶解液含量為30%時(shí)，DPPH清除率最高，為（80.20±0.27）%。所以推測(cè)紫蘇酶解液的加入可以提升紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化性。試驗(yàn)選取酶解液含量25%、30%和35%作為正交試驗(yàn)中該因素的3個(gè)水平。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

由圖4可得，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，紫蘇發(fā)酵乳的·OH清除率迅速升高又急劇降低，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)，·OH清除率最高，為（45.75±3.57）%；培養(yǎng)時(shí)間從8 h延長至10 h，紫蘇發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率急劇增加，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，DPPH自由基清除率緩緩降低，所以，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為（73.87±0.59）%。在發(fā)酵過程中，開菲爾菌也會(huì)吸收營養(yǎng)、生長擴(kuò)大，所以推測(cè)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，大量營養(yǎng)物質(zhì)被開菲爾菌代謝，影響了紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化活性。試驗(yàn)選取培養(yǎng)時(shí)間10 h、12 h和14 h作為正交試驗(yàn)中該因素的3個(gè)水平。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紫蘇粕發(fā)酵乳體外抗氧化性的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

由于各因素對(duì)紫蘇發(fā)酵乳體外抗氧化活性的影響并不是單一線性的，實(shí)際上是受到開菲爾菌接種量、加糖量、紫蘇酶解液含量和培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素交叉影響，為了考察這4個(gè)因素對(duì)紫蘇發(fā)酵乳抗氧化活性的交互影響，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)（L9（34））進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以紫蘇發(fā)酵乳的羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率為試驗(yàn)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素和正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表1、表2，·OH清除率和DPPH自由基清除率的方差分析見表3、表4。

由表2可得，在正交試驗(yàn)的各因素中，酶解液含量、培養(yǎng)時(shí)間、開菲爾菌接種量、加糖量對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化活性影響依次增大。通過比較指標(biāo)總和與各因素的關(guān)系可看出影響紫蘇發(fā)酵乳抗氧化活性的最佳的工藝條件組合是A3B1C2D1，即開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養(yǎng)時(shí)間10 h。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（P＜0.05），由表3可得，在正交試驗(yàn)的各因素中，加糖量對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的羥基自由基清除率有顯著影響（P＜0.05）。由表4可得，在正交試驗(yàn)的各因素中，開菲爾菌接種量、加糖量對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率有顯著影響（P＜0.05）。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果

將正交試驗(yàn)所得的最佳工藝條件組合進(jìn)行驗(yàn)證，在開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養(yǎng)時(shí)間10 h的工藝條件下制備紫蘇發(fā)酵乳，測(cè)定其·OH清除率、DPPH自由基清除率，做三組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所得·OH清除率平均值、DPPH自由基清除率平均值分別為（97.64±0.63）%和（97.90±0.69）%。所以，開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，酶解液含量30%，培養(yǎng)時(shí)間10 h即為比較穩(wěn)定的較優(yōu)生產(chǎn)條件。

3 結(jié)論

以提油之后的紫蘇籽粕為原料，以開菲爾菌發(fā)酵紫蘇酶解液，以羥基自由基（·OH）清除率、DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，采用單因素法和正交試驗(yàn)法，對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的體外抗氧化活性工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究了開菲爾菌接種量、加糖量、紫蘇酶解液含量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率的影響，結(jié)果表明：加糖量對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的羥基自由基清除率有顯著影響（P＜0.05），開菲爾菌接種量、加糖量對(duì)紫蘇發(fā)酵乳的DPPH清除率有顯著影響（P＜0.05）。所以，紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化活性的最佳生產(chǎn)工藝條件為：開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養(yǎng)時(shí)間10h，在此條件下所得紫蘇發(fā)酵乳的抗氧化活性較高。

表2 L9（34）的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗(yàn)羥基清除率方差分析

表4 正交試驗(yàn)DPPH清除率方差分析