白藜蘆醇預(yù)處理通過STIM1通路減少鈣離子內(nèi)流減輕心肌缺血再灌注中的損傷

徐 寒，吳繼雄*

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230000）

急性心肌梗死作為當(dāng)今世界上致死率最高的疾病之一，最有效的治療方式為及時(shí)開通冠脈血管，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療以及冠狀動(dòng)脈旁路移植等是最有效的治療方式，但也同時(shí)帶來了心肌缺血再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，缺血期心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na+和H+迅速增加；再灌注期細(xì)胞鈉-鈣交換蛋白和鈉-氫交換體被激活[2-3]。此外，再灌注時(shí)產(chǎn)生的大量氧自由基致使心肌細(xì)胞膜和肌質(zhì)網(wǎng)膜通透性增加，激活凋亡相關(guān)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[1，6，8]。近年的研究證實(shí)，鈣庫(kù)操作性鈣離子通道是介導(dǎo)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要通道之一[4，7]。白藜蘆醇具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血管舒張功能、抗血小板聚集等作用。而抑制鈣離子內(nèi)流，減輕鈣離子超載也已被證實(shí)是白藜蘆醇防治MIRI的作用機(jī)制之一[7]。

1 材料與方法

1.1 乳鼠心肌細(xì)胞提取

選擇SD大鼠出生1～3天的乳鼠，消毒后再胸骨左緣、第四肋間縱向剪斷肋骨，抬起乳鼠胸部，心臟可自行從胸腔中彈出，胰酶過夜，加入膠原酶消化至沒有完整心肌組織。

1.2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，改為PBS液，于37℃、95%N2、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h。后更換為含10%FBS的培養(yǎng)基，于37℃、20%O2、5%CO2中培養(yǎng)3h。

1.3 MTS細(xì)胞活力測(cè)定

在96孔板中，吸出原培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后每孔100μL培養(yǎng)基加入20μL MTS液。加入后在37℃，5%CO2的環(huán)境下避光孵育2小時(shí)。

1.4 Western blot

常規(guī)配制分離膠和濃縮膠，每孔加入10～50 μg蛋白上樣量，進(jìn)行電泳。采用濕轉(zhuǎn)法，開始轉(zhuǎn)膜；以一抗稀釋液稀釋一抗，膜放入一抗內(nèi)，4℃孵育過夜；加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h.

1.5 Ca2+測(cè)定

為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量，在室溫下加入Flu-3-AM液，孵育30分鐘。在熒光顯微鏡下拍照分析。

1.6 腺病毒轉(zhuǎn)染

心肌細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗后加入腺病毒，37℃，5%CO2培養(yǎng)30分鐘后，使用熒光顯微鏡拍攝及分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±EM）表示，采用GraphPad Prism Software Version 5.0統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇預(yù)處理可以減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷

結(jié)果表明，H/R損傷組MTS法測(cè)定的細(xì)胞活力低于對(duì)照組，白藜蘆醇預(yù)處理能夠提高細(xì)胞活力（圖1A）。實(shí)驗(yàn)表明，H/R損傷組的LDH釋放明顯高于對(duì)照組（圖1B）。白藜蘆醇的預(yù)處理可以使STIM 1表達(dá)下調(diào)，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)（圖1C）。

2.2 STIM1過表達(dá)可以增加心肌細(xì)胞在缺血再灌注中心肌細(xì)胞的損傷，增加凋亡蛋白的表達(dá)

將腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷。轉(zhuǎn)染效果由熒光顯微鏡下觀察及WB確定（圖2A）。預(yù)處理后凋亡蛋白顯著下降，但這一保護(hù)作用部分被STIM1過表達(dá)所阻斷（圖2B和2C）。

圖1 （A）不同劑量白藜蘆醇對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力的影響（P＜0.05）。（B）白藜蘆醇對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞壞死的影響。*P＜0.0 5。（C）不同劑量組凋亡蛋白WB結(jié)果，與對(duì)照組比較*P＜0.05；與H/R組比較#P＜0.05。Ca2+熒光強(qiáng)度經(jīng)白藜蘆醇處理后明顯降低。與對(duì)照組比較*P＜0.05，#P＜0.05。

圖2 （A）48小時(shí)后心肌的腺病毒感染效率（B）腺病毒轉(zhuǎn)染的NRVC的細(xì)胞活力，*P＜0.05與對(duì)照組比較，#P＜0.05與I/R組比較。（C）在STIM 1高表達(dá)心肌細(xì)胞中，白藜蘆醇預(yù)處理組凋亡蛋白和STIM1表達(dá)與對(duì)照組比較P＜0.05。

3 討 論

我們研究了原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧處理，結(jié)果表明，白藜蘆醇通過抑制STIM 1的表達(dá)并減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，減輕H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。同時(shí)，能夠增加Bcl-2表達(dá)、降低促凋亡蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果揭示了白藜蘆醇預(yù)處理在心肌缺氧復(fù)氧中的保護(hù)作用。此外，STIM 1過表達(dá)的腺病毒載體轉(zhuǎn)染顯著提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，這與心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后引起的STIM1表達(dá)增加是同時(shí)發(fā)生的。

我們檢測(cè)了H/R損傷后凋亡蛋白的變化。結(jié)果表明，白藜蘆醇能明顯降低H/R損傷引起的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇預(yù)處理可以顯著上調(diào)bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)[4-6]。此外，轉(zhuǎn)染STIM 1特異性腺病毒載體的NRVCs在白藜蘆醇預(yù)處理后可引起細(xì)胞凋亡增加。在白藜蘆醇處理和H/R損傷后，STIM1過度表達(dá)導(dǎo)致Bcl-2降低，Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)增加。因此，上述結(jié)果提示，抑制STIM 1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+積累和隨后引起的細(xì)胞凋亡可能是白藜蘆醇心肌保護(hù)作用的作用機(jī)制之一。