綠豆芽保鮮與細胞壁自溶機理分析

方良月，肖 瀟，傅 亮

(暨南大學 理工學院，食品科學與工程系，廣州 510632)

綠豆芽富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有多種生物活性成分，如類黃酮和酚酸等[1-2]，具有一定的解毒、抗炎、降膽固醇及利尿功能[3]。近年來，綠豆芽以口感好、價格便宜等優(yōu)點，在蔬菜市場上銷量呈快速上升趨勢。目前，綠豆芽已從作坊式轉(zhuǎn)入規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，出現(xiàn)了大量日產(chǎn)50t～500t的工廠[4]。綠豆芽極其脆嫩，且自身代謝快，常溫下貯存期極短，從出菜到銷售，若處理不當就會造成腐爛變質(zhì)，極大地降低產(chǎn)品的安全性和商品價值。研究方便、低成本及安全的綠豆芽保鮮技術是有力推動綠豆芽產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的重要基礎。

目前，工業(yè)上綠豆芽保鮮主要采用冷藏法。另有研究者通過其他技術路線嘗試探討綠豆芽的保鮮技術，如羅欣等[5]通過丙酸桿菌素清洗綠豆芽，使4℃冷藏條件下綠豆芽的保鮮期較對照延長了2d。王瀚博[6]利用UV-B輻照處理發(fā)芽60h的綠豆芽，發(fā)現(xiàn)適當?shù)腢V-B處理可有效降低失水率，有利于綠豆芽保鮮。Sikora等[7]采用抗壞血酸溶液浸泡綠豆芽，顯著降低綠豆芽中多酚氧化酶的活性，改善了貯藏過程中綠豆芽的消費品質(zhì)。阿魏酸是一種天然安全的具有清除自由基及調(diào)節(jié)細胞防御機制的酚酸[8]，此外還有保護心臟[9]、治療糖尿病[10]等一系列潛在的作用，有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸與纖維素酶混合孵育時能抑制纖維素酶活性[11]；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)是金屬螯合劑，可螯合酶的活性位點，使酶失活[12]，Li等[13]研究獼猴桃中分離純化的多聚半乳糖醛酸酶活性時，發(fā)現(xiàn)EDTA濃度高于2mmol·L-1時，該酶活受到抑制。目前，關于綠豆芽貯藏保鮮與細胞壁水解酶的關系也鮮見報道。本試驗通過不同溫度貯藏綠豆芽，比較貯藏過程中綠豆芽新鮮狀態(tài)、理化指標的差異及下胚軸微觀結構的變化，分析綠豆芽腐爛與其下胚軸細胞壁自溶的關系。在此基礎上采用阿魏酸和EDTA作為酶抑制劑處理綠豆芽，探究抑制綠豆芽細胞壁水解酶活性對其保鮮的影響，以期為綠豆芽的有效保鮮提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用綠豆芽源于實驗室豆芽機制作：挑選顆粒飽滿的綠豆，蒸餾水清洗除雜后，置于ψ=1%次氯酸鈉水溶液中消毒浸泡15 min，用蒸餾水反復沖洗3次后，放入蒸餾水中浸泡6 h，于豆芽機中避光發(fā)芽96 h后采收。

1.2 試驗設計與處理

1.2.1 不同溫度貯藏綠豆芽保鮮試驗 稱取每份250 g新鮮綠豆芽，裝于密封保鮮袋中，分別置于4 ℃、10 ℃、20 ℃、25 ℃及30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光貯藏(每組3個平行)，每隔12 h取樣測定各項生理生化指標。

1.2.2 酶抑制劑處理綠豆芽貯藏保鮮試驗 根據(jù)保鮮預試驗及感官評定結果進行保鮮效果的初步優(yōu)化，確定阿魏酸及EDTA作為酶抑制劑處理綠豆芽的質(zhì)量濃度均為0.1 g·L-1。稱取250 g新鮮綠豆芽，分別置于溶解有阿魏酸、EDTA的 2 L水溶液中浸泡30 min，取出后用2 L蒸餾水清洗兩遍，吸水紙吸干表面水分，以蒸餾水中進行相同處理作對照(CK)，分別裝入密封保鮮袋中25 ℃避光貯藏(每組3個平行)，每隔12 h測定纖維素酶活性、果膠酶活性及感官評分，并觀察貯藏48 h時下胚軸的微觀結構。

1.3 測定指標與方法

感官評價：參照文獻[14-15]，由10名食品專業(yè)人員組成的評定小組，綜合評價綠豆芽貯藏過程中子葉顏色、根部顏色、氣味及下胚軸顏色、出水程度、軟化程度等狀態(tài)，評價標準如表1。

pH測定：稱取2 g綠豆芽，加入5 mL蒸餾水研磨， 4 ℃、12 000 × g離心10 min，收集上清液測pH。

維生素C質(zhì)量分數(shù)的測定：稱取10 g綠豆芽，按照文獻[16]對綠豆芽中的維生素C進行提取測定。

顯微觀察：隨機選取綠豆芽，在下胚軸距葉 4～5 cm處進行切片，每組10個切片，用光學顯微鏡觀察綠豆芽下胚軸橫切面的微觀結構并拍照。

纖維素含量的測定：參照文獻[17]，稱取10 g綠豆芽于燒杯中，冰水浴加入60 mLφ=60% H2SO4，消化30 min后，量取20 mL消化液加水定容至100 mL，布氏漏斗過濾，收集上清液作纖維素提取液備用，取2 mL提取液，加入0.5 mLw=2%的蒽酮溶液搖勻，再沿壁加入5 mL濃硫酸(冰水浴)，靜置12 min后620 nm處測吸光度值。

果膠含量的測定：稱取5 g綠豆芽研磨，加入6 mL 1 mol·L-1H2SO4，70 ℃水浴20 min， 12 000×g離心15 min，收集上清液，定容至50 mL，作為果膠提取液備用，參照文獻[18]測定。

纖維素酶活性的測定：稱取10 g綠豆芽，加入20 mL經(jīng)預冷的φ=95%乙醇，冰浴研磨后，低溫靜置10 min，4 ℃、1 2000 × g離心20 min，棄去上清液，向沉淀中加入10 mL經(jīng)預冷的φ=80%乙醇振蕩，低溫靜置10 min，相同條件離心，向沉淀中加入5 mL經(jīng)預冷的提取液，振蕩后低溫靜置20 min，再次離心收集上清液即為酶提取液，依據(jù)文獻[16]測定。

果膠酶活性的測定：采用同果膠酶相同方法提取，按照文獻[16]測定。

表1 綠豆芽感官評價標準Table 1 Standard of sensory evaluation of green bean sprouts

注：感官評分 < 85，認為綠豆芽新鮮狀態(tài)不可接受。

Note：Sensory score < 85, freshness of green bean sprouts was unacceptable.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2011進行數(shù)據(jù)處理并作圖，用SPSS 22.0進行差異顯著性分析(以P<0.05為顯著差異)及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對綠豆芽保鮮的影響

2.1.1 感官評價的變化 由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，綠豆芽的新鮮狀態(tài)(感官評分)逐漸下降。貯藏溫度與綠豆芽貯藏過程中的感官評分極顯著相關(P<0.01，r=- 0.555)。低溫 (4 ℃、10 ℃)貯藏的綠豆芽貯藏前60 h其感官評分均 > 85，處于新鮮狀態(tài)，20° C貯藏的綠豆芽儲藏前36 h，感官評分 > 85，較新鮮，25 ℃貯藏的綠豆芽貯藏前24 h，感官評分 ≥ 85，新鮮狀態(tài)可接受，30 ℃貯藏的綠豆芽在貯藏24 h時，其感官評分 < 85，新鮮狀態(tài)不可接受。48 h時，25 ℃和30 ℃貯藏的綠豆芽表面出現(xiàn)明顯的汁液流出，下胚軸變軟，出現(xiàn)異味；60 h時，其組織結構已嚴重軟腐，汁液流失嚴重，無法進行取樣測定觀察。因此，后續(xù)試驗只對綠豆芽裝袋后0、12、24、36、48 h進行取樣測定。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) under various treatments, the same below

圖1 不同溫度貯藏過程中綠豆芽感官評分的變化
Fig.1 Changes of sensory scores ingreen bean sprouts during storageof different temperatures

2.1.2 pH的變化 如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，綠豆芽pH呈上升趨勢。貯藏前12 h，各組綠豆芽較新鮮，pH上升較慢，基本呈弱酸性，24 h后，30 ℃ 貯藏的綠豆芽pH與20 ℃及25 ℃貯藏的均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)；貯藏溫度越高，新鮮狀態(tài)越差，pH上升越快。30 ℃貯藏的綠豆芽pH在48 h時達7.70，呈弱堿性，而4 ℃和10 ℃貯藏的綠豆芽pH一直保持相對穩(wěn)定。pH的變化與感官評分高度相關(P<0.01，r=-0.815)，反映了貯藏過程中綠豆芽品質(zhì)的變化。

圖2 不同溫度貯藏過程中綠豆芽pH的變化Fig.2 Changes of pH in green bean sprouts during storage of different temperatures

2.1.3 維生素C質(zhì)量分數(shù)的變化 綠豆芽貯藏過程中維生素C質(zhì)量分數(shù)的變化如圖3，隨貯藏時間的延長，維生素C質(zhì)量分數(shù)先升高后緩慢下降，前期綠豆芽較新鮮，其自身合成代謝旺盛，導致維生素C質(zhì)量分數(shù)上升，后期質(zhì)量分數(shù)下降是由于綠豆芽細胞成熟老化加劇，致使維生素C降解導致質(zhì)量分數(shù)下降。貯藏至48 h時，4 ℃貯藏的綠豆芽維生素C質(zhì)量分數(shù)較高，20 ℃及25 ℃次之，30 ℃貯藏的質(zhì)量分數(shù)最低，僅為4 ℃質(zhì)量分數(shù)的 54.4%，綠豆芽的新鮮狀態(tài)也最差。維生素C質(zhì)量分數(shù)是衡量果蔬品質(zhì)的重要指標，其質(zhì)量分數(shù)的變化反映了綠豆芽貯藏過程品質(zhì)的變化。

圖3 不同溫度貯藏過程中綠豆芽維生素C質(zhì)量分數(shù)的變化Fig.3 Changes of vitamin C mass fraction in green bean sprouts during storage of different temperatures

2.1.4 下胚軸結構的變化 如表2，隨著貯藏時間的延長，綠豆芽新鮮狀態(tài)發(fā)生變化，下胚軸出現(xiàn)大小不同程度的中空結構。貯藏0 h時，各組綠豆芽均較新鮮，其下胚軸橫截面細胞飽滿且排列緊密，貯藏12 h時20 ℃、25 ℃及30 ℃貯藏的綠豆芽下胚軸橫截面出現(xiàn)空洞，隨后空洞面積逐漸增大；貯藏至24 h時，4 ℃及10 ℃貯藏的綠豆芽下胚軸橫截面出現(xiàn)較小面積的空洞，貯藏至48 h時，其下胚軸空洞面積略微增大。說明綠豆芽的新鮮狀態(tài)與下胚軸中空結構的出現(xiàn)及其面積大小有關。綠豆芽下胚軸出現(xiàn)空洞結構，表明組織內(nèi)部微觀結構發(fā)生變化，細胞壁排列由緊密變疏松，導致胞間層結構改變，細胞壁破壞。

表2 不同溫度貯藏過程中綠豆芽下胚軸橫切面顯微結構(×40)
Table 2 Microstructure of hypocotyl cross-section in green bean sprouts during storage of different temperatures(×40)

2.1.5 纖維素含量的變化 由圖4可知，綠豆芽貯藏過程中纖維素含量隨貯藏時間先上升后下降，前12 h，綠豆芽自身合成代謝致使纖維素含量上升，隨后綠豆芽新鮮狀態(tài)開始下降，下胚軸橫切面出現(xiàn)空洞，纖維素含量也隨之下降，而且貯藏溫度越高，綠豆芽新鮮狀態(tài)越差，纖維素含量也越低。纖維素是細胞壁的分子骨架，其含量下降，說明細胞壁結構遭到了破壞。

2.1.6 果膠質(zhì)量濃度的變化 圖5所示，隨貯藏時間的延長，果膠質(zhì)量濃度逐漸下降。貯藏12 h后，4 ℃及10 ℃貯藏的綠豆芽果膠質(zhì)量濃度顯著(P<0.05)高于20 ℃、 25 ℃及30 ℃貯藏組，其新鮮狀態(tài)也較好，與纖維素質(zhì)量濃度的變化基本保持一致。纖維素和果膠均是細胞壁的主要組成成分，兩者含量的降低說明細胞壁水解，發(fā)生了自溶，解釋了綠豆芽下胚軸出現(xiàn)空洞的現(xiàn)象。

2.1.7 纖維素酶活性變化 由圖6知，綠豆芽纖維素酶活性隨貯藏時間呈上升趨勢。20 ℃、 25 ℃及30 ℃貯藏的綠豆芽纖維素酶活前期上升緩慢，36 h后酶活急劇上升，且貯藏溫度越高，酶活性上升越快；低溫(4 ℃)貯藏的綠豆芽纖維素酶活性一直處于較低水平。纖維素酶活性的變化與纖維素含量的變化高度相關(P<0.01，r= -0.524)。纖維素酶是導致細胞壁中纖維素水解和質(zhì)地軟化的重要原因，酶活性升高時會加速纖維素的水解，導致纖維素含量下降，致使細胞壁結構松散，從而使綠豆芽下胚軸出現(xiàn)中空結構。

圖4 不同溫度貯藏過程中綠豆芽纖維素含量的變化Fig.4 Changes of cellulose content in green bean sprouts during storage of different temperatures

圖5 不同溫度貯藏過程中綠豆芽果膠質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Changes of pectin mass concentration in green bean sprouts during storage of different temperatures

圖6 不同溫度貯藏過程中綠豆芽纖維素酶活性的變化Fig.6 Changes of cellulase activity in green bean sprouts during storage of different temperatures

2.1.8 果膠酶活性變化 如圖7所示，隨著貯藏時間的延長，綠豆芽果膠酶活性整體呈上升趨勢，果膠酶活性的變化與果膠含量的變化高度相關 (P<0.01，r=- 0.835)。前12 h，各組綠豆芽果膠酶活性差異不顯著(P>0.05)，24 h后果膠酶活性差異顯著(P<0.05)，溫度越高，新鮮狀態(tài)越差，果膠酶活性越高。表明隨著綠豆芽新鮮狀態(tài)下降，其內(nèi)部果膠酶活性升高，使組成細胞壁的主要成分水解，果膠含量下降，導致細胞壁自溶，從而出現(xiàn)綠豆芽組織軟腐、汁液流失的現(xiàn)象。

2.2 酶抑制劑處理對綠豆芽保鮮的影響

如圖8和圖9所示，阿魏酸及EDTA處理的綠豆芽貯藏過程中纖維素酶和果膠酶活性均比對照組低，且貯藏過程中感官評分也高于對照組，有利于綠豆芽新鮮狀態(tài)的維持。其中，對照組綠豆芽貯藏24 h時，其感官評分 < 85，新鮮狀態(tài)不可接受，而此時阿魏酸和EDTA處理的綠豆芽感官評分 > 85，較新鮮；貯藏36h時，EDTA處理的綠豆芽開始變軟變壞，其感官評分 < 85，阿魏酸處理的綠豆芽48 h時開始變壞，相比于對照組，EDTA及阿魏酸處理分別可使綠豆芽25 ℃保鮮時間延長12 h、24 h。貯藏至48 h時，阿魏酸及EDTA處理的綠豆芽下胚軸中空結構面積均比對照組小(表3)，表明阿魏酸及EDTA處理均能抑制纖維素酶和果膠酶的活性，緩解細胞壁自溶，從而延遲空洞結構的形成，有利于綠豆芽保鮮。

圖7 不同溫度貯藏過程中綠豆芽果膠酶活性的變化Fig.7 Changes of pectinase activity in green bean sprouts during storage of different temperatures

圖8 酶抑制劑處理綠豆芽貯藏過程中纖維素酶活性及果膠酶活性的變化Fig.8 Changes of cellulase activity and pectinase activity during storage of green bean sprouts treated with different enzyme inhibitors

圖9 酶抑制劑處理綠豆芽貯藏過程中感官評分的變化Fig.9 Changes of sensory scores during storage of green bean sprouts treated with different enzyme inhibitors

表3 酶抑制劑處理綠豆芽貯藏至48 h時下胚軸橫切面顯微結構
Table 3 Microstructure of hypocotyl cross-sectionin green bean sprouts treated withdifferent enzyme inhibitors stored for 48 h

3 討 論

近年來，已有不少關于果蔬貯藏品質(zhì)與細胞壁自溶的關系研究。解越等[19]將茄子分別在 2 ℃、12 ℃及20 ℃下貯藏，分析貯藏溫度對其活性氧代謝及細胞壁降解的影響，綜合比較得出， 12 ℃為茄子最適宜的貯藏溫度。林河通等[20]在 10 ℃貯藏‘褔眼’龍眼，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，原果膠及纖維素含量不斷減少，果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶及纖維素酶活逐漸升高，果肉自溶指數(shù)及細胞壁自溶程度不斷增加。本試驗通過不同溫度貯藏綠豆芽，得到腐敗速率不同的綠豆芽，通過顯微觀察，隨著貯藏時間的延長，綠豆芽下胚軸會出現(xiàn)中空結構，且綠豆芽新鮮度越低，中空結構的面積越大；結合綠豆芽貯藏過程中纖維素、果膠含量及纖維素酶、果膠酶活性的變化，說明綠豆芽的腐敗及下胚軸中空結構的出現(xiàn)與其細胞壁自溶有關。因此，若能抑制綠豆芽細胞壁中纖維素酶與果膠酶的活性，減緩壁自溶，則可能有效延長保鮮期。

趙云峰等[21]通過熱水處理龍眼降低了果肉細胞壁降解酶的活性從而達到延長保鮮的效果，Ortiz等[22]采用超低氧和鈣處理蘋果抑制細胞壁降解酶的活性，降低了硬度的損失。本試驗采用阿魏酸與EDTA溶液分別處理綠豆芽，其纖維素酶與果膠酶活均受到一定程度的抑制，減緩了下胚軸中空結構面積的增大，緩解細胞壁自溶，從而延長綠豆芽的保鮮期，與對照組相比，EDTA處理可使綠豆芽25 ℃貯藏保鮮時間延長12 h，阿魏酸處理可延長24 h，說明通過抑制綠豆芽細胞壁中纖維素酶及果膠酶的活性來延長綠豆芽的保鮮期的技術路線是合理的。后續(xù)研究還需繼續(xù)優(yōu)化降低綠豆芽纖維素酶和果膠酶活性的技術路線，以便開發(fā)出更方便、高效、安全的保鮮方案。