黃野螟蛻皮激素受體基因HvEcR的鑒定及表達(dá)分析

呂子豪，李治興，林 同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642)

黃野螟(HeortiavitessoidesMoore)是一種寡食性的食葉害蟲[1-2]，其寄主為國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物土沉香(AquilariasinensisSprenger)[3]。該蟲生長季節(jié)蟲口爆發(fā)迅速，數(shù)日便可把葉片吃光，造成枯苗、死苗，嚴(yán)重影響植株生長，制約結(jié)香的產(chǎn)量與質(zhì)量，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1,4]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于黃野螟的研究大多集中在生物學(xué)特性、行為學(xué)、農(nóng)藥防治技術(shù)方面，關(guān)于昆蟲生長調(diào)節(jié)劑防治及其分子方面的研究鮮見報(bào)道。

蛻皮激素核受體EcR是核受體超家族成員[5]，最早在果蠅(Drosophilamelanogaster)中得到鑒定[6]，具有蛻皮激素(Ecdysteroid hormones, EH) 配體專一性[7]， EH通過其進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。高20E濃度條件下，EcR與另一個(gè)蛻皮激素受體——超氣門蛋白(Ultraspiracle，USP)會被誘導(dǎo)形成異二聚體，進(jìn)而激活一系列早期應(yīng)答基因與晚期基因的表達(dá)[8-11]。因此，EcR在昆蟲蛻皮和變態(tài)過程中具有重要作用。

蛻皮是由數(shù)種激素協(xié)同調(diào)控的昆蟲生長發(fā)育所必需的復(fù)雜生命過程[12]，蛻皮激素與保幼激素(Juvenile hormone，JH)的協(xié)同作用在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛻皮激素需經(jīng)過一系列羥基化作用，被激活為具有更高活性的20-羥基蛻皮酮(20E)才能發(fā)揮作用[13-16]。當(dāng)JH滴度較高時(shí)，20E引起昆蟲脫皮，當(dāng)JH滴度較低，20E誘導(dǎo)昆蟲進(jìn)入下一齡期或發(fā)生變態(tài)[17]。EcR接受20E信號后，一系列蛻皮級聯(lián)反應(yīng)將被啟動。因此，研究昆蟲的EcR基因具有相當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)意義。本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測HvEcR基因在黃野螟各發(fā)育階段及幼蟲組織中的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)明確HvEcR的表達(dá)量對20E脅迫的響應(yīng)，豐富了EcR的分子生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

于廣州天鹿湖森林公園采集蟲卵及1至5齡試蟲，飼喂新鮮土沉香葉片，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度26 ℃，相對濕度75%，光期14 h，暗期10 h。20E試劑購自上海源葉生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ)購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(TB GreenTMPremix Ex TaqTM)均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 野外采集工作后，立即用液氮處理卵(3片)及各蟲態(tài)幼蟲(各5頭)，存放于 -80 ℃冰箱中；其余個(gè)體飼養(yǎng)至老熟幼蟲時(shí)，轉(zhuǎn)移到鋪有2 cm厚沙土(相對濕度為50%)的塑料養(yǎng)蟲盒中，待其化蛹羽化后，用同樣方法收集蛹及成蟲(各5頭)。選取40頭健康的4～5齡幼蟲，經(jīng)清洗、消毒后，在臘盤上解剖，獲取幼蟲體壁、頭、脂肪體、中腸、馬氏管等組織樣品，立即置于無菌去酶的凍存管中，經(jīng)液氮速凍后，存放于 -80 ℃冰箱。

1.2.2 蛻皮激素脅迫處理 先用DMSO將20E稀釋至10 mg/mL，存放于-20℃冰箱，備用。試驗(yàn)時(shí)用1×PBS將20E稀釋至30 ng/ μL和150 ng/ μL 2個(gè)質(zhì)量濃度。采用注射法對4齡幼蟲進(jìn)行蛻皮激素脅迫，用φ=75%酒精擦拭蟲體，蟲體置于冰上麻醉后，從腹部側(cè)面注射。每頭蟲子注射1 μL液體，對照組為等量稀釋的DMSO。注射后繼續(xù)用沉香葉片飼養(yǎng)于人工氣候箱中，分別于注射后24、48、72 h取樣。

1.2.3 RNA提取與cDNA合成 嚴(yán)格按照E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ試劑盒說明書提取各樣本總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以及微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測合格后，置于 -80 ℃冰箱保存，備用。嚴(yán)格按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書，將總RNA(0.8 μg)逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，稀釋20倍后，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4 基因表達(dá) 從黃野螟轉(zhuǎn)錄組文庫篩選出具有完整ORF框的EcR基因序列，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(RT-qPCR)檢測其表達(dá)量，所用內(nèi)參基因?yàn)棣?actin；所用目的基因引物為：Forward:5′-GCCAACCAGCAGTTCCTCATCG-3′和Reverse:5′-CGTCCTCTTCCTCCGTTGATTGC-3′；陰性對照為無菌超純水處理；反應(yīng)體系包括cDNA模板 20 μL，TB Green Premix ExTaq 10.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃解鏈10 s，60 ℃延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值，使用2-△△Ct相對定量法計(jì)算HvEcR相對表達(dá)量。用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析與鄧肯分析。

1.3 生物信息學(xué)分析、同源比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

在multalin網(wǎng)站(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)進(jìn)行氨基酸序列同源比對，采用ExPASy-ProtPram軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測，采用PSORT在線工具(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)預(yù)測亞細(xì)胞定位，采用NPS在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4. pl)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，采用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/yrSsgx/models/)模擬EcR蛋白高級結(jié)構(gòu)，采用ClustalX軟件和MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 HvEcR基因序列及蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

從黃野螟轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出具有完整ORF框的目的片段，將其命名為HvEcR(登錄號：MH588318)，序列全長1 734 bp，包含1 638 bp長的ORF框，共編碼545個(gè)氨基酸。使用ProtPram軟件對HvEcR的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白的分子質(zhì)量為61.70 ku，理論等電點(diǎn)為5.89，脂肪指數(shù)為73.71，不穩(wěn)定性指數(shù)為68.47，為不穩(wěn)定蛋白，總平均疏水性為 -0.442，為親水性蛋白。NetPhos 3.1軟件的預(yù)測結(jié)果為：HvEcR含絲氨酸位點(diǎn)16個(gè)，蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)各2個(gè)(得分大于0.9)。

Signal P 4.1軟件預(yù)測結(jié)果為：HvEcR不存在信號肽，為非分泌蛋白。根據(jù)PSORTII軟件預(yù)測的亞細(xì)胞定位結(jié)果可知，HvEcR位于線粒體的可能性最大，為60.9%，其次是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，分別有26.1%和8.7%的可能性，位于細(xì)胞骨架可能性則較低，僅為4.3%。TMpred軟件跨膜區(qū)分析結(jié)果為，無得分大于500的跨膜螺旋。TMHMM 軟件基于隱馬爾可夫模型(hidden Markov model)的跨膜螺旋預(yù)測結(jié)果為，HvEcR被標(biāo)記在外部，不含跨膜螺旋。蛋白的疏水性越強(qiáng)，其疏水區(qū)為跨膜區(qū)的可能性就越大，HvEcR無跨膜區(qū)，符合上文的親水性預(yù)測結(jié)果。

Conserved Domains軟件分析表明(圖1)，HvEcR含有EcR家族典型的DNA結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)和配體結(jié)合域(Ligand binding domain，LBD)。SMART軟件分析顯示，HvEcR由6個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，分別為兩段鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger，ZF)，3個(gè)低密度復(fù)雜區(qū)(low complexity region，LCR)和1個(gè)配體結(jié)合域(圖2)。這兩個(gè)軟件的分析結(jié)果進(jìn)一步證明篩選出的HvEcR基因與其他昆蟲的EcR一樣，均為核受體家族成員。經(jīng)SOPMA和SWISS-MODEL軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和建模，結(jié)果顯示，HvEcR編碼的蛋白主要由α-螺旋與無規(guī)則螺旋組成，它們分別占36.15%和48.62% (圖3)。

圖1HvEcR蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1 Putative conserved domain of HvEcR

低密度復(fù)雜區(qū)以大括號標(biāo)注；鋅指結(jié)構(gòu)域以陰影標(biāo)注；配體結(jié)構(gòu)域以方框標(biāo)注；終止密碼子TAG以星號標(biāo)注 LCRs are marked in braces; ZFs are marked with shadow; LBD is marked with boxes; the termination codon is marked with asterisk

圖2 黃野螟EcR基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofEcRgene fromH.vitessoides

圖中彩虹條表示從N端到C端的氨基酸 The rainbow bar represents the amino acid from N-terminal to C-terminal

圖3HvEcR的三維結(jié)構(gòu)
Fig.3 Three-dimensional structure ofHvEcR

2.2 同源比對及系統(tǒng)發(fā)育樹

在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源搜索，用multalin軟件進(jìn)行同源比對，結(jié)果表明，HvEcR序列與三化螟和二化螟的同源性最高，分別高達(dá)96%和92%(圖4)?；邝[翅目12種昆蟲的EcR氨基酸序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，黃野螟與水稻三化螟和二化螟的親緣關(guān)系最近，結(jié)果與同源性比對一致(圖5)。

2.3 黃野螟HvEcR基因的時(shí)空動態(tài)表達(dá)

黃野螟發(fā)育階段表達(dá)譜顯示(圖6)，以HvEcR在卵期的表達(dá)量為對照，HvEcR的轉(zhuǎn)錄水平在各發(fā)育時(shí)期差異顯著，在成蟲時(shí)達(dá)到峰值，為對照的12倍；其次是5齡幼蟲時(shí)，為對照的 5.68倍。在3齡幼蟲時(shí)表達(dá)量最低，僅為卵的 0.22。

由圖7可知，HvEcR在黃野螟幼蟲各組織中均有表達(dá)，在體壁中表達(dá)量最低，設(shè)為對照；在脂肪體中表達(dá)較高，為對照的4.54倍。其次，HvEcR在頭與馬氏管中也有較高表達(dá)，分別為對照的2.85倍和2.49倍。

用質(zhì)量濃度分別為30 ng/μL、150 ng/μL的蛻皮激素溶液和等量稀釋的DMSO溶液處理黃野螟4齡幼蟲，于處理后24 h、48 h和72 h檢測HvEcR基因的表達(dá)情況。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖8)，在兩種質(zhì)量濃度處理24 h后，均能引起HvEcR基因的表達(dá)量上調(diào)。在注射質(zhì)量濃度為150 ng/μL，處理時(shí)間為48 h時(shí)，HvEcR表達(dá)量上調(diào)最為明顯，為對照的4.10倍。結(jié)果表明，HvEcR基因的表達(dá)受20E調(diào)控。

3 討 論

本研究鑒定1條黃野螟HvEcR基因，其編碼的氨基酸含2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域、1個(gè)配體結(jié)構(gòu)域和3個(gè)低密度復(fù)雜區(qū)等6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，具有與其他昆蟲EcR相似的典型的基因家族特征。HvEcR與其他鱗翅目昆蟲EcR的親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化過程中十分保守。

作為蛻皮激素的受體，HvEcR的表達(dá)水平可能與20E滴度密切相關(guān)[18]，本研究結(jié)果顯示，黃野螟HvEcR的表達(dá)水平可能受20E的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)(圖8)。蛻皮激素與保幼激素共同參與每一齡幼蟲的組織重建和表皮形成[19]。RT-qPCR結(jié)果顯示，HvEcR在卵期及1～4齡幼蟲時(shí)表達(dá)量較低且相對穩(wěn)定，到5齡時(shí)達(dá)到小高峰，到蛹期又降低，與昆蟲不同發(fā)育時(shí)期體內(nèi)蛻皮激素的變化趨勢一致[20-21]。因此，推測HvEcR對黃野螟末齡幼蟲的發(fā)育起重要作用，可能與組織重建和預(yù)蛹發(fā)育有關(guān)[22]。蛻皮激素參與昆蟲成蟲的卵子發(fā)生和生殖過程[17]，在黃野螟成蟲體內(nèi)，HvEcR有高表達(dá)，推測作為蛻皮激素受體的EcR也與該過程有關(guān)[23]。

圖5 基于昆蟲EcR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic relationships of insects based on amino acids of EcR

EcR存在昆蟲不同組織中，參與20E介導(dǎo)下的組織重建，如EcR在埃及伊蚊 (Aedesaegypti)幼蟲中參與組織溶解過程，在家蠶和水稻二化螟幼蟲脂肪體中特異性表達(dá)，在果繩中參與神經(jīng)元重建[24-27]。對黃野螟幼蟲不同組織的HvEcR轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其主要在脂肪體中表達(dá)，為對照的4.54倍。脂肪體是昆蟲重要的能量貯備中心，且在物質(zhì)代謝中扮演關(guān)鍵角色，作為蛻皮激素受體，HvEcR可能與黃野螟營養(yǎng)儲存及能量代謝有關(guān)。除在脂肪體表達(dá)外，HvEcR在馬氏管和頭部中也有較高表達(dá)，但其功能需進(jìn)一步澄清。

數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”；柱上字母代表差異顯著(P< 0.05)；圖7、圖8同 Data in the figure are represented as mean ± SD；different letters mean significant difference on the bar (P<0.05). The same as Fig.7 and 8;E.卵 Egg；L1、L2、L3、L4、L5.1～5齡幼蟲 Larve stage 1-5；P.蛹 Pupal；A.成蟲 Adult

圖6HvEcR基因在黃野螟各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)
Fig.6 The expression level ofHvEcRindevelopmental stages ofH.vitessoides

IN.體壁 Integument；HE.頭 Head；FA.脂肪體 Fat body；MG.中腸 Midgut；MT.馬氏管 Malpighian tubule

圖7HvEcR基因在黃野螟幼蟲中的表達(dá)
Fig.7 The expression level ofHvEcRin the larvae ofH.vitessoides

研究昆蟲EcR的分子機(jī)制，不僅有助于深入理解昆蟲的蛻皮行為，還能為害蟲防控提供新思路。基于本試驗(yàn)對黃野螟HvEcR功能的初步研究，后續(xù)還將通過RNA干擾技術(shù)及相關(guān)生理生化試驗(yàn)，進(jìn)一步研究該基因的功能，為開發(fā)環(huán)境友好型的EcR靶標(biāo)殺蟲劑提供更多的分子生物學(xué)參考。

圖8 不同時(shí)間不同質(zhì)量濃度的20E處理對HvEcR基因表達(dá)的影響Fig.8 Expression profile of HvEcR at differrent time and different 20E mass concentration