水稻中2個小分子熱激蛋白基因啟動子的序列分析及功能鑒定

郭虹霞，王創(chuàng)云，趙 麗，王陸軍，張麗光，鄧 妍

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，太原 030031)

水稻作為最主要的糧食作物之一，世界約50%的人口以稻米為主要糧食，為人類的糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)。水稻的生長在一定程度上受到各種逆境脅迫的影響，溫度是影響水稻生長發(fā)育最主要的氣候因子，研究表明，適溫以上，氣溫每升高1℃，水稻的產(chǎn)量會減少10%[1]。全球氣溫的持續(xù)升高，嚴(yán)重制約著水稻的生產(chǎn)，當(dāng)前亟需深入水稻耐熱的分子機(jī)制研究，確保水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)是指生物遭受逆境脅迫時(如高溫)體內(nèi)新合成或含量增加的一類具有分子伴侶活性的蛋白質(zhì)[2]。根據(jù)分子質(zhì)量的大小，熱激蛋白可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP(small heat shock proteins)[3-4]5個家族，小分子熱激蛋白(sHSPs)是最重要的一類分子伴侶，其分子質(zhì)量一般為15～50ku，不同于其他大部分熱激蛋白家族成員間的高度保守， sHSPs基因間的氨基酸序列相似性不足25%，在其二級結(jié)構(gòu)中含有一個80～100個氨基酸組成的保守的ACD(α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域)結(jié)構(gòu)域。sHSPs在植物熱激蛋白中含量最為豐富[5]，與植物耐熱性關(guān)系密切[3]。正常生長條件下，大多數(shù)sHSP在植物組織中不積累,而在熱激或其他脅迫的誘導(dǎo)下，sHSP 的含量急速增加[6]，有的甚至可提高200倍以上；有些sHSP在植物生長發(fā)育的特定時期如胚胎發(fā)生、花粉粒發(fā)育、種子萌發(fā)、種子及果實成熟等過程中表達(dá)[7-8]。研究表明，高溫脅迫下，sHSP能自發(fā)形成大小為200～300ku的同源寡聚體，并與其他分子伴侶相互作用，幫助受損蛋白重新折疊。除了在耐熱脅迫方面的重要作用外，sHSPs對冷、旱、鹽等脅迫的防御也具有重要作用[9]。研究表明，超表達(dá)水稻Hsp17.7基因，可以提高水稻的耐熱性和抗旱性[10-11]，過量表達(dá)葉綠體sHSPs[12-13]和ER-sHSPs[14]能提高番茄的抗寒性。此外，sHSPs還有抑制細(xì)胞凋謝、促進(jìn)細(xì)胞骨架形成，及保護(hù)電子傳遞鏈(線粒體sHSP)和光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞(葉綠體sHSP)等作用[15]。

前期研究表明，在水稻幼穗分生組織進(jìn)行枝梗原基分化和花器官原基分化初期有種類豐富的熱激蛋白基因及其共分子伴侶和熱激轉(zhuǎn)錄因子高水平特異表達(dá)。其中2個基因是位于1號染色體編碼sHSP的基因Os01g0136200和Os01g 0136100(分別命名為Os16.9A和Os16.9B)，Os16.9A和Os16.9B大小相同，結(jié)構(gòu)相似，都不含內(nèi)含子。

本試驗對Os16.9A和Os16.9B的啟動子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用過量表達(dá)和Cas9基因編輯技術(shù)研究Os16.9A和Os16.9B與水稻耐熱性的關(guān)系，為深入研究Os16.9A和Os16.9B的功能奠定了基礎(chǔ)，對深入了解熱激蛋白參與植物正常生長發(fā)育及防御脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試植物材料為粳稻品種‘中花11’，大腸桿菌菌株DH10B為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所實驗室保存；植物超表達(dá)載體pBWA(V)KS-ccDB和基因編輯載體pBWA(V)H_cas9i2- 01g04380由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司提供；限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2購自Takara公司；凝膠回收試劑盒購自東盛生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA測序由上海英駿生物技術(shù)公司完成。

1.2 生物信息學(xué)分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上，利用tBLASTN軟件對Os16.9A、Os16.9B基因進(jìn)行同源性分析，通過DNAStar、MEGA6軟件構(gòu)建Os16.9A、Os16.9B及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 基因克隆及載體構(gòu)建

1.3.1 過表達(dá)載體構(gòu)建 以水稻葉片cDNA為模板總RNA。根據(jù)Os16.9A、Os16.9B序列設(shè)計引物(表1)，按照如下反應(yīng)體系(引物1：0.2 μmol/L ，引物2：0.2 μmol/L，dNTP：200 μmol/L，10×Buffer：2 μL，Taq：1U，cDNA：4 ng，ddH2O：補(bǔ)齊50 μL)擴(kuò)增(98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸15 min，14 ℃10 min)目的片段，切膠、回收。將用凝膠純化試劑盒回收的 PCR 產(chǎn)物與空載體pBWA(V)KS-ccDB連接，轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒后，進(jìn)行菌液 PCR，選PCR 擴(kuò)增結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行測序。重組載體見圖1。

1.3.2 基因編輯載體構(gòu)建 根據(jù)Os16.9A、Os16.9B全長cds及基因組序列，在盡量靠近cds 5′端選定4個靶標(biāo)，設(shè)計引物(表1),將靶標(biāo)構(gòu)建至中間載體，PCR反應(yīng)條件為，95 ℃變性10 min，55 ℃退火10 min然后利用EcoR31Ⅰ限制性內(nèi)切酶切割中間載體并進(jìn)行多片段的組裝，獲得最終載體(圖2)，由于Os16.9A、Os16.9B序列的高度同源性，2個基因共用一個載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 Os16.9A和 Os16.9B的同源性分析

通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 和http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/ 網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)Os16.9A和Os16.9B均位于水稻1號染色體PAC克隆P0443D08上，大小相同，轉(zhuǎn)錄方向相反(圖3)，且都含有共同的Alpha-crystallin結(jié)構(gòu)(圖4)，將克隆的Os16.9A和Os16.9B所編碼的150個氨基酸進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，僅存在一個氨基酸的差異(圖5)，相似性高達(dá)到99%，軟件分析預(yù)測顯示Os16.9A和Os16.9B蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

注：1-4表示構(gòu)建超表達(dá)載體引物，5-12表示構(gòu)建基因編輯載體引物；下劃線為酶切位點。

Note:1-4 Primers for over-expression vectors，5-12 primers for gene editing vectors；the underline marked the digestion site.

圖1 過表達(dá)載體圖譜Fig.1 Overexpression vector map

圖2 基因編輯載體圖譜Fig.2 Gene editing vector map

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

利用網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/對Os16.9A和Os16.9B的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示在水稻中與這2個基因的氨基酸相似性達(dá)50%以上的基因有8個，這些基因主要分布在1號染色體和3號染色體上，很可能是通過祖先基因的多次復(fù)制產(chǎn)生的。通過DNAStar、MEGA6軟件構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，這些蛋白可分為7個亞枝，Os16.9A和Os16.9B在同一分枝上，且Os16.9A、Os16.9B與Os01g0136000處于同一亞枝，表明Os16.9A、Os16.9B與Os01g0136000蛋白的親緣關(guān)系較近，而與其余蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 目的基因在PAC克隆上的位置Fig.3 The location of target genes on PAC clones

a. Os16.9A；b. Os16.9B；c.Alpha-crystallin結(jié)構(gòu)域 Alpha-crystallin domain

圖5 Os16.9A、 Os16.9B基因的氨基酸序列比較Fig.5 Amino acid sequences comparison of Os16.9A and Os16.9B

圖6 水稻中 Os16.9A、 Os16.9B氨基酸水平同源基因進(jìn)化樹Fig.6 The phylogenetic tree of Os16.9A and Os16.9B proteins from rice

2.3 啟動子序列分析

對2個基因起始密碼子間2 590 bp的序列正反向進(jìn)行了啟動子元件分析(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，發(fā)現(xiàn)其中不對稱分布了多種順式作用元件(圖7，表2)，其中HSE、ACGT aterd1、NTBBF1arrolb、GATA-box、CAAT-box、TATA-box在Os16.9A和Os16.9B啟動子區(qū)都存在，但是相對起始密碼子所在的位置有差別，而且Os16.9A和Os16.9B的TATA-box的具體序列不同。此外，G-box、LTRE、CCAAT-box是Os16.9A啟動子區(qū)所特有的，BSI是Os16.9B啟動子區(qū)所特有的。推測Os16.9A和Os16.9B可能在熱激等環(huán)境脅迫下及植物生長的特定時期表達(dá)，2個基因啟動子可能共用起始密碼子之間2 590 bp的序列或者這段序列可能具有雙向啟動子功能。

紅色標(biāo)注Os16.9B的啟動子元件 The red is the promoter element ofOs16 .9B；綠色標(biāo)注Os16.9A的啟動子元件 The green is the promoter element ofOs16 .9A；兩基因轉(zhuǎn)錄方向相反 The two genes are transcribed in the opposite direction

圖7Os16.9A、Os16.9B基因起始密碼子間的序列及其包含的啟動子元件
Fig.7 The sequence between the initiating codons of theOs16.9AandOs16.9Bgenes and the promoter elements

表2 Os16.9A、 Os16.9B啟動子元件序列及功能Table 2 The sequences and function of Os16.9A and Os16.9B promoter elements

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的耐熱分析

為了研究Os16.9A和Os16.9B與水稻耐熱性的關(guān)系，本研究通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得了Os16.9A和Os16.9B的過量表達(dá)及基因編輯轉(zhuǎn)化植株。同時將在同樣生長條件下的4葉期野生型‘中花11’、過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和基因編輯轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐熱處理，比較它們的耐熱性是否存在差異。在42 ℃高溫處理2 h后，于正常生長環(huán)境下恢復(fù)生長3～5 d后觀察植株的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況好于野生型‘中花11’，而基因編輯轉(zhuǎn)基因植株則出現(xiàn)比較明顯的萎蔫，枯黃現(xiàn)象，生長狀況比野生型‘中花11’差 (圖8)。

熱處理前后，分別提取過表達(dá)、基因編輯及野生型‘中花11’植株葉片RNA，利用RT-PCR的方法檢測Os16.9A表達(dá)情況，結(jié)果表明，在正常生長條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量較對照‘中花11’高，而編輯轉(zhuǎn)基因植株中基本沒有表達(dá)；42 ℃熱激2 h后，‘中花11’和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量有所增加(圖9)。

a-c. 未處理的植株 Untreated plants; d-f. 42 ℃熱激處理2 h，恢復(fù)正常生長5 d后的植株 Plants treated at 42 ℃ for 2 h,then grow under normal growth conditions for 5 days; a、d . 過表達(dá)Os16.9B轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plants overexpressingOs16.9B; b、e .‘中花11’對照 ‘ZH11’ controls; c、f .Os16.9B基因編輯轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plants ofOs16.9Bgene deiting

圖8 苗期熱激處理
Fig.8 Heatshock treatment of rice seedling

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DL2000 marker； 1-4.未熱激植株的RT-PCR結(jié)果 Result of the untreated plants ； 5-7. 42 ℃熱激2 h植株RT-PCR結(jié)果 Result of the plants treated at 42 ℃ for 2 hours； 1、2、5. ‘中花11’ ‘ZH11’; 3、6.Transgenic plants overexpressingOs16.9B;4、7.Os16.9B基因編輯轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plants ofOs16.9Bgene deiting

圖9 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR結(jié)果
Fig.9 RT-PCR result of transgenic plants

3 討 論

水稻是世界上重要的糧食作物，高溫脅迫可嚴(yán)重影響水稻的育性和品質(zhì)，因此需要對水稻耐熱的分子機(jī)制進(jìn)行研究，確保水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

高等植物復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。啟動子作為重要的調(diào)控開關(guān)，對其結(jié)構(gòu)及功能的研究具有重要作用。Os16.9A和Os16.9B都編碼小分子熱激蛋白(sHSPs)，通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)Os16.9A和Os16.9B是位于水稻1號染色體PAC克隆P0443D08上的2個基因，它們的編碼框大小相同， 都不含有內(nèi)含子。Os16.9A和Os16.9B之間僅存在1個氨基酸差異，氨基酸序列的相似性高達(dá)到99%，且都存在Alpha-crystallin結(jié)構(gòu)，但是編碼框外的序列，如5′UTR和3′UTR則完全不同。

本研究對Os16.9A和Os16.9B起始密碼子間2 590 bp的序列分析，發(fā)現(xiàn)多種順式作用元件在2個基因啟動子區(qū)的分布是不對稱的，且大多與脅迫誘導(dǎo)和組織特異性表達(dá)有關(guān)。因此，推測這2個基因間的序列可能具有雙向啟動子的功能，且這2個基因可能在熱激等脅迫條件下及植物生長的特定時期表達(dá)。利用GUS報告融合系統(tǒng)對2個基因表達(dá)特性的研究結(jié)果[16]表明熱激會誘導(dǎo)這2個基因的大量表達(dá)，而在正常生長條件下，Os16.9A和Os16.9B在根、莖、幼穗的維管組織中表達(dá)，兩者的表達(dá)模式無論是在脅迫環(huán)境下還是正常發(fā)育過程中都基本相似，驗證了本試驗對于這2個基因間的序列可能具有雙向啟動子的功能，且這2個基因可能在熱激等脅迫條件下及植物生長的特定時期表達(dá)的推測。對轉(zhuǎn)基因植株的熱激處理發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Os16.9A和Os16.9B能夠提高水稻對高溫脅迫的耐受能力。

4 結(jié) 論

Os16.9A和Os16.9B起始密碼子之間2 590 bp的序列作為雙向啟動子驅(qū)動這2個基因反向轉(zhuǎn)錄，Os16.9A和Os16.9B的表達(dá)模式相似，在正常生長條件下，對于根、莖、幼穗的維管組織等分化和發(fā)育有關(guān)，且在熱激等環(huán)境脅迫時，能夠提高水稻對高溫等脅迫的耐受能力。