雙價(jià)豬流行性腹瀉病毒特異性雙峰駝源單域抗體的重組表達(dá)和特征分析

李 麗，楊順利，張辛銘，蔡建平，薛慧文，尹雙輝

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

豬流行性腹瀉病毒(Poreine epidemic diarrhea virus，PEDV) 屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是引起豬流行性腹瀉(PED)的病原。PED是一種急性接觸性傳染病，可通過糞便、污染的飲水、飼料和環(huán)境迅速散播，病豬的主要特征為腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡階段的豬均可感染發(fā)病，但對哺乳仔豬具有較高致死率。目前的流行病學(xué)調(diào)查研究表明，PEDV已經(jīng)遍及全球[1-2]，亞洲的爆發(fā)頻率也不斷增加，尤其是在養(yǎng)豬業(yè)較為發(fā)達(dá)的中國[3-5]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，滅活和弱毒疫苗已經(jīng)在臨床廣泛使用，但由于PEDV感染的免疫學(xué)特征以及病毒的不斷變異，臨床不斷有PED發(fā)病和流行的報(bào)道。因此，對PED的快速、準(zhǔn)確檢測，及時(shí)切斷其傳播環(huán)節(jié)，仍是PED防控的重要舉措。

抗體是常見血清學(xué)和病原學(xué)檢測方法中的重要組成部分，抗體的特性很大程度上決定了檢測方法的準(zhǔn)確性和敏感性。重鏈抗體(HCAbs)是發(fā)現(xiàn)于駝科和軟骨魚等動(dòng)物體內(nèi)的一種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的抗體[6]。這類抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成，稱此可變區(qū)片段為單域抗體(Single domain antibody，sdAb)，由于其分子質(zhì)量僅15 ku，是單克隆抗體的1/3，因此也稱其為納米抗體(Nanobody)。sdAb是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子，sdAb具有比普通抗體更大的重鏈可變區(qū)(VH)抗原結(jié)合環(huán)結(jié)構(gòu)，更長的第三互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)，能夠形成更多的新結(jié)構(gòu)，因而補(bǔ)償了輕鏈可變區(qū)(VL)抗原結(jié)合位點(diǎn)的缺失，僅靠3個(gè)CDR就具備特異的抗原結(jié)合能力及高親和力。此外，已有研究證實(shí)sdAb還具有容易在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、具有高水溶性、耐高溫和極端pH等獨(dú)特性質(zhì)[7-8]。鑒于此，sdAb在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、診斷和治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-12]。

成本低廉、獲得容易、具有高親和性和特異性的抗體是檢測方法研發(fā)所追求的理想材料。本研究對已經(jīng)獲得的4株P(guān)EDV 膜蛋白特異性sdAb(sdAb-Mcs)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建雙價(jià)抗體。分析雙價(jià)抗體的溫度耐受性、pH耐受性、競爭活性和M蛋白捕獲特性，獲得具有很好病原捕獲活性和競爭活性的雙價(jià)sdAb-Mcs。為建立高度敏感和特異的PEDV檢測方法提供廉價(jià)的材料基礎(chǔ)，同時(shí)也為sdAb的有效應(yīng)用提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)涉及的限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司；異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工；膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；His-tag純化樹脂購自德國Qiagen公司；96孔酶標(biāo)板購自美國Coster公司； 0.45 μm濾膜和PVDF膜購自德國millipore公司；牛血清白蛋白(BSA)，碳酸鹽包被緩沖液和TMB底物顯色液購自美國Sigma公司；HRP酶標(biāo)記抗His-tag抗體購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；HRP酶標(biāo)記抗兔抗體購自美國Abcom公司；ECL顯色液購自美國Thermo公司；pET-32a表達(dá)載體、帶有His和GST標(biāo)簽的重組PEDV膜蛋白、膜蛋白高免兔血清以及膜蛋白特異性sdAb為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所豬禽消化道感染和黏膜免疫研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 PEDV特異性單域抗體結(jié)構(gòu)模擬分析及雙價(jià)抗體的構(gòu)建 利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 在線軟件，對PEDV特異性單域抗體sdAb-Mc19(Genbank access NO.: MH550664)、sdAb-Mc29(MH550665)、sdAb-Mc30(MH550666)和sdAb-Mc37(MH550 667)[13]，進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬分析。用已公布的雙峰駝源sdAb晶體結(jié)構(gòu)(5lz0)為模板[14]，利用SPDBV 4.0 軟件繪結(jié)構(gòu)圖。

利用BamHⅠ，HindⅢ和XholⅠ酶切位點(diǎn)，將雙拷貝的sdAb-Mc19/29/30/37基因分別克隆到 pET-32a(+) 載體，同時(shí)兩個(gè)拷貝sdAb之間引入15個(gè)氨基酸的柔性氨基酸序列[15]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆并進(jìn)行測序分析。

1.2.2 雙價(jià)sdAb的表達(dá)、純化與鑒定 將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，將含有重組質(zhì)粒PET-32a-sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37的單菌落分別接種到新鮮Lysogeny broth(LB)培養(yǎng)基(含100 μg/mL Ampicillin)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照體積比1∶100的接種量，將菌轉(zhuǎn)接至3 mL 新鮮LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL Ampicillin)中，振搖至OD600約為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度 0.001 mol/L，25 ℃誘導(dǎo)10 h后，8 000 r/min離心收集菌體。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

確定表達(dá)后，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，收集菌體。用Tris-HCL緩沖液(pH 8.0)重懸，置冰上用超聲儀進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清。上清液用0.45 μm濾膜過濾并加入到His標(biāo)簽蛋白親和層析柱，按操作說明進(jìn)行目的蛋白純化。獲得的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測濃度后，分裝，-80 ℃保存。

Western blot驗(yàn)證，將表達(dá)菌液上清用φ=12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)到PVDF膜。用BSA-PBS 封閉液 (1×PBS，含50 g/L的BSA，pH 7.4) ， 4 ℃，過夜封閉；次日，用PBST (1×PBS，含φ=0.1% Tween-20，pH 7.4) 洗3次；然后，與HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽蛋白單克隆抗體室溫孵育1 h，PBST洗5次后，用ECL底物顯色液，暗盒曝光顯色。

1.2.3 重組雙價(jià)sdAb-Mcs與M蛋白結(jié)合活性分析 用間接ELISA方法，檢測重組雙價(jià)sdAb-Mcs與M蛋白的結(jié)合活性[13]。用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋帶有GST標(biāo)簽的重組M蛋白(M-GST)至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，過夜包被酶標(biāo)板；次日，用PBST洗板3次，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉1 h；PBST再次洗板3次，加入系列稀釋的sdAb-Mc19-19/29-29/30-30/37-37至終質(zhì)量濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16 和 0 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃孵育1 h；隨后，PBST洗板5次，加入HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽蛋白抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗板，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液，室溫避光孵育15 min；讀取OD450值。設(shè)置GST標(biāo)簽蛋白包被孔為對照。

同時(shí)，通過Western blot 方法驗(yàn)證雙價(jià)sdAb-Mcs與M-GST蛋白的結(jié)合活性。用12% SDS-PAGE分離M-GST蛋白后，轉(zhuǎn)到PVDF膜；用BSA-PBS封閉緩沖液，室溫封閉PVDF膜 2 h；然后將PVDF膜與sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37，4 ℃過夜孵育；隨后，PBST洗膜5次，并與HRP標(biāo)記抗His抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗膜5次，用ECL底物顯色液，暗盒曝光顯色。

1.2.4 溫度耐受性分析 將重組的單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs分別置于30～90 ℃水浴1 h，然后，通過ELISA方法檢測不同溫度處理后的抗體M蛋白結(jié)合活性。過程如下：用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋M-GST蛋白至10 μg/mL，過夜包被酶標(biāo)板；然后，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉 2 h；PBST洗板3次，加入不同溫度條件下處理的sdAb，質(zhì)量濃度為5 μg/mL，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h；再次洗板5次，加入HRP標(biāo)記的抗His抗體， 37 ℃ 孵育1 h；洗板5次，加入TMB底物顯色液，室溫避光15 min；讀取OD450值。

1.2.5 pH耐受性分析 將重組的單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs分別置pH為2～11的Tris-HCl中，重組抗體質(zhì)量濃度為5 μg/mL。然后，將不同pH的重組抗體加入到M-GST蛋白(10 μg/mL)包被的酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h；隨后，PBST洗板5次，加入HRP標(biāo)記的抗His抗體，37 ℃孵育1 h；再次洗板，加入TMB底物顯色液，室溫避光 15 min；讀取OD450值。

1.2.6 競爭活性分析 分別將2.5 μg、5 μg、10 μg和20 μg的單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs與1∶200稀釋的M蛋白免疫兔血清(PBS為稀釋液)混合，混勻后加入M-GST蛋白(10 μg/mL)包被的酶標(biāo)版，每孔50 μL，室溫，放置于微孔板震蕩器(QB-9001)，震速200，作用2 h；之后，PBST洗板5次，加入1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記抗兔第二抗體，每孔50 μL，室溫孵育1 h；再次洗板，加入TMB底物顯色液，室溫避光15 min；讀取OD450值。同時(shí)，設(shè)置未混合sdAb-Mcs的兔血清對照組。競爭率計(jì)算公式為：競爭率=(兔血清孔OD450值-兔血清與sdAb-Mcs混合孔OD450值)/兔血清孔OD450值× 100%。

1.2.7 對M蛋白捕獲特性分析 用碳酸鹽包被緩沖液稀釋重組單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs至20 μg/mL，每孔50 μL，4 ℃，過夜包被酶標(biāo)版；然后，用PBST洗板5次，用BSA-PBS封閉緩沖液室溫封閉1 h；再次洗板5次，拍干孔內(nèi)殘留液體，加入質(zhì)量濃度為0.1 g/L的重組M蛋白，每孔50 μL，室溫，震蕩孵育2 h，吸出孔內(nèi)液體，用Nanodrop 2000 測蛋白質(zhì)量濃度，計(jì)算質(zhì)量濃度變化值，比較分析不同sdAb-Mcs結(jié)合M蛋白的差異。用t-test 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析單價(jià)與雙價(jià)抗體捕獲M蛋白的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV特異性sdAb結(jié)構(gòu)模擬及雙價(jià)抗體表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果顯示，sdAb-Mc19、sdAb-Mc29、sdAb-Mc30和sdAb-Mc37與已報(bào)道的雙峰駝源sdAb 5lz0具有相似的空間結(jié)構(gòu)，僅在CDR3結(jié)構(gòu)域存在一些差異(圖1-a)。

利用這些sdAb-Mcs按照圖1-b所示的方式，構(gòu)建含雙拷貝sdAb-Mcs基因的原核表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-sdAb-Mc19-19 /29-29 /30-30 /37-37，測序分析連接目的基因片段正確后，提取質(zhì)粒，備用。

2.2 雙價(jià)sdAb的表達(dá)、純化與鑒定

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DE3)，用0.001 mol/L的IPTG 誘導(dǎo)，SDS-PAGE結(jié)果，IPTG誘導(dǎo)組出現(xiàn)大小約為40 ku的表達(dá)條帶，與目標(biāo)蛋白大小相符；大量誘導(dǎo)收獲菌體，利用His標(biāo)簽蛋白純化樹脂進(jìn)行純化，可以得到預(yù)期大小的蛋白，進(jìn)一步通過Western blot方法驗(yàn)證，結(jié)果同樣出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶(圖1-c)。

2.3 重組雙價(jià)sdAb-Mcs與M蛋白結(jié)合活性 分析

通過ELISA和Western blot 檢測重組雙價(jià)sdAb-Mcs與M蛋白的結(jié)合活性。ELISA結(jié)果顯示，M蛋白包被孔的OD450值隨著雙價(jià)sdAb-Mcs加入量增加而變大，而GST標(biāo)簽蛋白包被孔的OD450值與空白對照孔值相近，并且隨著雙價(jià)sdAb-Mcs加入量增加OD450值沒有規(guī)律性變化(圖2-A)；Western blot 結(jié)果出現(xiàn)大小與M-GST相符的單一條帶，這些結(jié)果一致表明重組雙價(jià)sdAb-Mcs具有M蛋白結(jié)合活性。

2.4 溫度耐受性分析

將重組sdAb-Mcs置于30～90 ℃溫度梯度下1 h，用ELISA方法檢測在不同溫度條件處理，是否會影響這些sdAb-Mcs的M蛋白結(jié)合活性。結(jié)果顯示在30～70 ℃條件下，并沒有明顯影響這些抗體的結(jié)合活性，而在80 ℃處理后結(jié)合活性明顯下降，90 ℃處理后，基本失去M蛋白的結(jié)合活性(圖3)。此外，單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs展示了相似的溫度耐受性，表明構(gòu)建雙價(jià)抗體并沒有影響sdAb-Mcs的溫度耐受性。

a. sdAb-Mcs的模擬結(jié)構(gòu)，粉色、紅色和綠色分別表示CDR1、CDR2 和 CDR3，字母N 和C分別表示N端和C端 Homology modeling of sdAb-Mcs.CDR1, CDR2 and CDR3 are represented in purple, red and green，respectively,the N- and C-terminal extremities are labelled N and C, respectively; b. 雙價(jià)抗體的構(gòu)建模式圖，利用BamHⅠ/HindⅢ和XholⅠ酶切位點(diǎn)，將雙拷貝的sdAb基因克隆到 pET-32a(+) 載體 Expression cassettes of bivalent sdAb-Mcs in pET-32a (+) vector,the sdAb-Mcs encoding gene is sub-cloned at theBamHⅠ/Hind Ⅲsite and theXhoⅠ Isite；c. 雙價(jià)抗體的表達(dá)、純化和Western blot 鑒定 Expression, purification, and verification of divalent sdAb-Mcs；1-4.分別為雙價(jià)抗體sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37的表達(dá) Expression of sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29, sdAb-Mc30-30 and sdAb-Mc37-37；5.為空白質(zhì)粒對照 Blank vector control；6-9.為sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37的純化 Purification of sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29, sdAb-Mc30-30 and sdAb-Mc37-37；10-13.分別為sdAb-Mc19-19、sdAb-Mc29-29、sdAb-Mc30-30和sdAb-Mc37-37表達(dá)的Western blot 鑒定 Verification by Western blot based on sdAb-Mc19-19, sdAb-Mc29-29 and sdAb-Mc30-30；M.為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker

圖1 sdAb-Mcs結(jié)構(gòu)分析及雙價(jià)抗體的構(gòu)建和表達(dá)
Fig.1 Structure of sdAb-Mcs cloning, expression and purification of bivalent sdAb-Mcs

2.5 pH耐受性分析

將這些重組sdAb-Mcs分別置于pH 2～11下，用ELISA方法，檢測不同pH對這些sdAb-Mcs的M蛋白結(jié)合活性的影響。結(jié)果顯示，在pH 2～10時(shí)，這些sdAb-Mcs均具備較好的M蛋白結(jié)合活性，而在pH為11時(shí)，結(jié)合活性明顯下降，在pH為2時(shí)表現(xiàn)出最佳的結(jié)合活性(圖4)。此外，單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs展示相似的pH耐受性，表明構(gòu)建雙價(jià)抗體并沒有影響sdAb-Mcs的pH耐受性。

2.6 競爭活性分析

將不同量的單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs分別與M蛋白免疫的兔血清混合，通過ELISA方法，檢測這些sdAb-Mcs與血清中M蛋白抗體的競爭結(jié)合活性。結(jié)果顯示這些sdAb-Mcs均具備一定的競爭活性，并且與單價(jià)sdAb-Mcs相比，雙價(jià)sdAb-Mcs展示更高的競爭活性(圖5)。

A. 雙價(jià)sdAb-Mcs與重組 M蛋白及GST標(biāo)簽蛋白的結(jié)合活性 The binding activity of bivalent sdAb-Mcs to recombinant M protein and GST-tag proteinwas analyzed; B. 驗(yàn)證構(gòu)建抗體與M蛋白的結(jié)合活性 The binding activity of bivalent sdAb-Mcs to recombinant M protein were verified by western blotbased on anti-His tag antibody

圖2 雙價(jià)sdAb的結(jié)合活性分析
Fig.2 Binding activity analysis of bivalent sdAb-Mcs to M protein

A.單價(jià)sdAb-Mc19和雙價(jià)sdAb-Mc19-19 在不同溫度條件處理后與M蛋白結(jié)合活性分析 The binding activity analysis of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 with M protein in different temperature condition by ELISA；B. sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29 ；C. sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D.sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖3 sdAb-Mcs溫度耐受性分析
Fig.3 Analysis of thermal tolerance of sdAb-Mcs

2.7 對M蛋白捕獲特性分析

將相同量的sdAb-Mcs包被酶標(biāo)板，加入適量M蛋白，通過檢測M蛋白的質(zhì)量濃度變化來分析這些sdAb-Mcs的抗原捕獲特性。結(jié)果在相同質(zhì)量濃度的條件下，雙價(jià)sdAb-Mcs展示更好的M蛋白捕獲特性(圖6)。

3 討 論

抗體分子通過其穩(wěn)定的構(gòu)象結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)對抗原分子的特異識別與結(jié)合。常規(guī)抗體通過重鏈和輕鏈可變區(qū)的6個(gè)CDR形成構(gòu)象來特異性識別抗原，而sdAb僅靠3個(gè)CDR就具備特異的抗原結(jié)合能力及高親和力，這可能與sdAb獨(dú)特的空間構(gòu)象有關(guān)。sdAb展現(xiàn)出比普通抗體更長的CDR區(qū)，能形成更大的VH抗原結(jié)合環(huán)結(jié)構(gòu)，并且具更長的CDR3，能夠形成更多的新結(jié)構(gòu)，使抗體構(gòu)象更為穩(wěn)定[16]，從而補(bǔ)償VL缺失導(dǎo)致的抗原結(jié)合位點(diǎn)的缺乏。本研究以公布的雙峰駝源sdAb(5lz0)晶體結(jié)構(gòu)為模板，對前期篩選的4株sdAb-Mcs進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬，分析發(fā)現(xiàn)4株sdAb-Mcs均與5lz0具有相似的空間結(jié)構(gòu)，只是在CDR3區(qū)存在一些差別，表明這幾株抗體均具有結(jié)合抗原的sdAb特征性構(gòu)象結(jié)構(gòu)，是進(jìn)行sdAb特性分析和應(yīng)用研究的可靠材料。

A. 單價(jià)sdAb-Mc19和雙價(jià)sdAb-Mc19-19 在不同pH條件下與M蛋白結(jié)合活性分析 The binding activity analysis of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 with M protein in different pH condition by ELISA；B.sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29；C.sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D.sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖4 sdAb-Mcs pH耐受性分析
Fig.4 Analysis of pH condition tolerance of sdAb-Mcs

A. 單價(jià)sdAb-Mc19和雙價(jià)sdAb-Mc19-19 與M蛋白高免兔血清的M蛋白競爭結(jié)合活性分析 The competition capacity of univalent sdAb-Mc19 and bivalent sdAb-Mc19-19 to anti-M protein polyclonal antibody was analyzed by a competitive ELISA；B. sdAb-Mc29和sdAb-Mc29-29 Same analysis on sdAb-Mc29 and sdAb-Mc29-29；C. sdAb-Mc30和sdAb-Mc30-30 sdAb-Mc30 and sdAb-Mc30-30；D. sdAb-Mc37和sdAb-Mc37-37 sdAb-Mc37 and sdAb-Mc37-37

圖5 多克隆抗體競爭特性分析
Fig.5 Analysis of competition capacity to anti-M protein polyclonal antibody

* 表示P<0.05 * represent P<0.05

PEDV是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重大病原，其傳播的廣泛性和對新生仔豬近100%的致死率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。對PEDV的早期、快速、準(zhǔn)確診斷對PED的防控和疫苗免疫具有重要指導(dǎo)意義。已有研究證實(shí)，通過構(gòu)建多價(jià)抗體的方式能夠提高抗體的病原中和活性[17]。本研究已經(jīng)利用篩選到的sdAb-Mcs建立PEDV檢測和分離的方法，并證實(shí)其適用于臨床樣品的病原檢測和分離[13]。為了建立更為高效的病原檢測和分離方法，本研究嘗試構(gòu)建二價(jià)sdAb，旨在進(jìn)一步提高這些抗體的病原親和特性，從而提高其應(yīng)用潛力。

sdAb具有十分穩(wěn)定抗原結(jié)合活性，即使經(jīng)過鹽酸胍和尿素等蛋白變性劑處理后，仍然保持抗原結(jié)合活性，甚至有些sdAb還能耐受高達(dá)90 ℃的高溫變性處理，而常規(guī)抗體在70 ℃處理后就完全失去抗原結(jié)合活性[7, 18]。本研究將重組的單價(jià)與雙價(jià)sdAb-Mcs在30～90 ℃下處理，發(fā)現(xiàn)這些sdAb-Mcs在溫度高達(dá)80 ℃時(shí)仍能夠保持部分抗原結(jié)合活性，表明sdAb-Mcs具備sdAb所固有的溫度耐受特性。然而不同的是，sdAb-Mcs在90 ℃處理后，則完全喪失抗原結(jié)合活性，這可能與sdAb本身CDR3區(qū)域的氨基酸組成有關(guān)，由于CDR3較長，其內(nèi)部的氨基酸，尤其是半胱氨酸，通過形成二硫鍵形成更為穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)來增加sdAb的穩(wěn)定性[16]。同時(shí)，比較單價(jià)和雙價(jià)sdAb的溫度耐受性發(fā)現(xiàn)，二者并沒有明顯的差異，表明構(gòu)建二價(jià)抗體并沒有影響sdAb的溫度耐受特性。

隨著研究的不斷深入，sdAb在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。在作為口服治療性抗體藥物研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，sdAb在空腸和胃液的條件下仍保持一定的結(jié)合活性[19]。在空腸和胃液條件下，sdAb除抵抗蛋白酶降解外，還要面臨極低的pH條件。本研究將重組sdAb-Mcs置于pH 2～11下，檢測其抗原結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)sdAb-Mcs在pH 2～10時(shí)均具備較好的結(jié)合活性，在pH 11時(shí)仍保持部分結(jié)合活性，而在pH 2時(shí)顯示出最佳的結(jié)合活性。這些結(jié)果表明，sdAb-Mcs具有較寬泛的pH耐受范圍，sdAb-Mcs能夠在極低pH下保持最佳的抗原結(jié)合活性，而在極堿性條件(pH 11)開始失去抗原結(jié)合活性。同時(shí)，比較單價(jià)和雙價(jià)sdAb-Mcs的pH耐受性發(fā)現(xiàn)，二者沒有明顯的差異，表明構(gòu)建二價(jià)抗體沒有影響sdAb-Mcs的pH耐受特性。

為了比較分析單價(jià)與雙價(jià)sdAb-Mcs的抗原親和特性，本研究進(jìn)行競爭ELISA和病原捕獲分析試驗(yàn)。競爭ELISA結(jié)果顯示，二價(jià)sdAb-Mcs具有更高的M蛋白多克隆抗體競爭活性，表明二價(jià)sdAb-Mcs比單價(jià)sdAb-Mcs具有更高的抗原親和活性。病原捕獲試驗(yàn)也證實(shí)二價(jià)sdAb-Mcs比單價(jià)sdAb-Mcs具有更高的病原捕獲活性。這些結(jié)果表明可以通過構(gòu)建二價(jià)抗體的方式來提高sdAb的抗原親和性。

本研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建二價(jià)抗體并沒有影響sdAb-Mcs的溫度和pH耐受性，并證實(shí) sdAb-Mcs在30～70 ℃和pH 2～10 條件下，均具備較好的抗原結(jié)合活性；進(jìn)一步分析證實(shí)，構(gòu)建的雙價(jià)抗體具備更好的多克隆抗體競爭活性和抗原捕獲活性，這些結(jié)果表明構(gòu)建二價(jià)抗體可以提高sdAb的抗原親和性；本研究為建立高度敏感和特異的PEDV檢測方法提供廉價(jià)的材料基礎(chǔ)，同時(shí)也為sdAb的有效應(yīng)用提供更多思路。