肺炎支原體感染豬模型的建立及相關(guān)指標(biāo)分析

倪黎綱，王宵燕，吳信生，趙旭庭,陶 勇

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of Swine, MPS)又稱為豬氣喘病，該病以高度傳染性、高發(fā)病率、慢性和低死亡率為特點[1]，感染豬主要表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、食欲減退、呼吸困難、生長速度緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率降低等[2]，該病廣泛流行于世界養(yǎng)豬業(yè)，在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家也普遍存在，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。不同品種豬對豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)的感染率不同，中國高繁殖力的地方豬種易感性比外來品種強(qiáng)，如姜曲海豬和梅山豬[3]。目前，研究發(fā)現(xiàn)不同豬種對肺炎支原體的易感性在機(jī)體本身的分子基礎(chǔ)方面存在差異，一些免疫相關(guān)分子基因的變異及其表達(dá)差異與肺炎支原體易感性相關(guān)，這些免疫相關(guān)分子基因包括 Toll 樣受體2(Toll like receptor2，TLR 2)、Toll 樣受體4(Toll like receptor4，TLR 4)、白細(xì)胞介素2(Interleukin2，IL-2)、白細(xì)胞介素4(Interleukin4，IL-4)、白細(xì)胞介素6(Interleukin6，IL-6)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin1beta，IL-1β)、CXC 趨化因子配體6(C-X-C Motif Chemokine Ligand6，CXCL 6)和 CXC 趨化因子配體8(C-X-C Motif Chemokine Ligand8，CXCL 8)[4-6]。然而，免疫相關(guān)分子的作用機(jī)理還知之甚少，需要進(jìn)一步研究和探索。

感染模型是研究致病機(jī)制的基礎(chǔ)，邵國青等[7]采用不同劑量豬肺炎支原體強(qiáng)毒株人工感染小梅山二元雜交豬，根據(jù)典型氣喘病臨床癥狀和肺部病變特征，開展豬氣喘病發(fā)病模型的研究，確定豬發(fā)病的人工感染劑量。其他有關(guān)豬氣喘病發(fā)病模型研究未見報道。雜交豬有著親本雙方不同的遺傳背景，是研究品種間遺傳差異較好的試驗動物。本試驗以對豬肺炎支原體易感的姜曲海豬和相對耐受的杜洛克豬的雜交一代[F1(杜洛克×姜曲海)豬]為參試動物，通過人工感染肺炎支原體，研究試驗豬的臨床病理特征和免疫抗體變化，并探索豬肺炎支原體對免疫相關(guān)分子基因表達(dá)的影響，建立較為完整的肺炎支原體感染豬模型，為進(jìn)一步探索中外豬種肺炎支原體致病機(jī)制的差異和篩選抗病育種分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與主要試劑

Mhp Js強(qiáng)毒株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；豬IgG檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；愛德士 (IDEXX) 豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒購自揚(yáng)州科能生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限 公司。

1.2 試驗動物

健康F1(杜洛克×姜曲海)試驗豬16頭，由江蘇姜曲海種豬場(江蘇泰州)提供，所有試驗豬均未注射肺炎支原體疫苗，RT-PCR(PCR)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬肺炎支原體病原(Mhp)均為陰性。

1.3 致病性試驗

試驗豬50日齡時，隨機(jī)分成感染組和陰性對照組。強(qiáng)毒株致病性試驗毒株劑量參照文獻(xiàn)[7](強(qiáng)毒株凍干物1∶100 稀釋液)，5 mL直接注入豬氣管中，固定豬頭部2～5 min，以免注射物被咳出，陰性對照試驗豬氣管注射5 mL無菌生理鹽水。試驗過程中所用飼料無抗生素添加。

1.4 稱體質(zhì)量、臨床評價、血清抗體和 IgG 檢測

試驗豬接種肺炎支原體強(qiáng)毒株后，所有試驗豬在第0、10、20、30、40天的清晨空腹稱體質(zhì)量，比較增量情況。稱體質(zhì)量的同時采集血液，分離血清，-20 ℃冷凍保存，采用 ELISA 方法參照試劑盒說明書檢測豬肺炎支原體抗體和 IgG 水平。試驗期間，每2 d觀察1 次豬的臨床癥狀，觀察時間15 min，包括一般健康狀況，食欲和咳嗽等。

1.5 肺組織病理檢查

在試驗結(jié)束(40 d)時屠宰所有試驗豬，分離肺臟，進(jìn)行病理檢查并進(jìn)行肺組織病變評分，評分標(biāo)準(zhǔn)和方法參照文獻(xiàn)[8-9]。然后無菌采集脾、肺和氣管組織樣品，立即放入液氮中，轉(zhuǎn)移到 -70 ℃冷凍保存。

1.6 脾、肺和氣管組織免疫相關(guān)分子基因轉(zhuǎn)錄檢測

取采集的脾、肺和氣管組織樣品，液氮研磨，按照 Trizol 試劑提取說明書提取總RNA，RNA 質(zhì)量濃度和純度通過分光光度計測定。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，采用兩步法合成 cDNA 第一鏈，-20 ℃冷凍保存。根據(jù) GenBank 中豬IL-1β、TLR 4、IL-4、IL-2的基因序列和GAPDH基因序列設(shè)計定量 PCR 引物(表1)，采用熒光定量 PCR 檢測免疫相關(guān)分子基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析處理。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-Time PCR primer sequences

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，采用t檢驗進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗豬臨床癥狀

試驗豬接種肺炎支原體強(qiáng)毒株9 d后，感染組豬群中有1 頭表現(xiàn)出間斷性輕微咳嗽，隨后感染組豬群中其他試驗豬逐漸表現(xiàn)輕微的咳嗽病狀；試驗16 d后，有2頭表現(xiàn)嚴(yán)重的腹式呼吸，咳嗽加劇，其他均只出現(xiàn)咳嗽、食欲下降等癥狀；試驗22 d后，所有感染組豬均出現(xiàn)明顯的支原體肺炎臨床癥狀，表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹式呼吸。整個試驗期，對照組豬均未出現(xiàn)咳嗽、食欲減退、精神萎靡等支原體肺炎臨床癥狀。

2.2 豬體質(zhì)量和日增量變化

整個試驗期，感染組豬群生長速度逐漸減慢(圖1)。試驗30 d后，感染組豬群的體質(zhì)量極顯著低于對照組豬群 (P<0.01)。在整個試驗期，感染組豬群的平均日增量極顯著低于對照組 (P<0.01)(表2)，提示肺炎支原體感染對豬的生長影響較大。

2.3 肺組織病理檢查

試驗豬剖解后肉眼觀察，肺炎支原體感染豬的肺臟心葉、尖葉、中間葉和隔葉邊緣均出現(xiàn)不同程度的暗紅色肉變(圖2)，支氣管和縱膈淋巴結(jié)稍有腫大，其他內(nèi)臟器官無明顯變化。肺組織病變評分結(jié)果見表2，感染組的肺組織病變評分主要集中在16～22這個中間類群，表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的肺組織病變；對照組的肺組織病變評分集中在0～15類群，未表現(xiàn)肺組織病變。

A. 感染組 Infection group;B.對照組 Control group; “**”表示在同一時間兩組數(shù)據(jù)之間存在極顯著差異 (P<0.01)，圖3和圖4同 “**” difference between two sets of data at the same time at the level ofP<0.01, the same as in Fig.3 and Fig.4

圖1 試驗豬的平均體質(zhì)量
Fig.1 Average body mass of experimental pigs

A. 對照健康豬肺臟 Lung tissue of the control healthy pig;B. 肺炎支原體感染豬肺臟 Lung tissue of Mhp infected pig;箭頭指示為病變組織 Lung pathological tissues are indicated with arrows

圖2 試驗豬肺臟
Fig.2 Lungs of experimental pigs

表2 試驗豬試驗期間的平均日增量和肺組織病變評分Table 2 Average body mass gain and pulmonary lesion score of experimental pigs

注：同列中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different uppercase letters in same columns indicate significant difference (P<0.01).

2.4 血清抗體和IgG檢測

通過對試驗豬血清肺炎支原體抗體水平檢測發(fā)現(xiàn)，感染組豬群血清肺炎支原體抗體水平逐漸上升，在試驗20 d時，感染組豬群血清中肺炎支原體抗體s/p值為0.40±0.13，呈現(xiàn)抗體滴度陽性，試驗結(jié)束(40 d)時，肺炎支原體抗體s/p值高達(dá)0.82±0.10(圖3)。整個試驗期，感染組豬群血清IgG質(zhì)量濃度呈現(xiàn)上升趨勢(圖4)，試驗 20 d后，感染組豬群血清IgG質(zhì)量濃度均極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.5 免疫相關(guān)分子基因表達(dá)檢測

采集感染組和對照組試驗豬的脾、肺、氣管組織，檢測IL-1β、TLR4、IL-4、IL-2mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，從感染組豬群的脾、肺組織中均檢測到IL-1β、TLR4、IL-4、IL-2的顯著表達(dá)(P<0.05)，其中，感染組豬群脾組織中IL-1β、IL-4、IL-2的表達(dá)極顯著高于對照組 (P<0 .01)，肺組織中IL-1β的表達(dá)極顯著高于對照組(P<0.01)。感染組豬群的氣管組織中這4個分子基因的表達(dá)情況與對照組差異不顯著 (P>0.05)。

圖3 試驗豬血清肺炎支原體抗體水平變化Fig.3 Mhp antibody levels in serum of experimental pigs

3 討 論

豬肺炎支原體以慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點[1]，豬感染肺炎支原體后，主要表現(xiàn)為食欲減退、咳嗽、氣喘、呼吸困難等癥狀[10]。邵國青等[7]將 Mhp Js 毒株(毒株凍干物 1∶100 稀釋液)人工接種到 55～65 日齡氣喘病檢查陰性的小梅山二元雜交豬氣管內(nèi)，接種后 25 d，試驗豬產(chǎn)生典型豬氣喘病癥狀和肺組織病變。杜德燕等[11]給試驗豬氣管內(nèi)接種肺炎支原體強(qiáng)毒株，接種 7 d 后試驗豬出現(xiàn)咳嗽現(xiàn)象，接種 25 d 后觀察到嚴(yán)重咳嗽、氣喘、食欲下降等臨床癥狀，在 25 d的攻毒觀察期內(nèi)，試驗豬生長速度受到顯著影響，肺部組織病變較為嚴(yán)重。在本研究中，試驗豬在一定劑量肺炎支原體感染后，在試驗 16 d 后出現(xiàn)支原體肺炎臨床癥狀，試驗 22 d 后表現(xiàn)出嚴(yán)重肺炎支原體感染的臨床癥狀，肺炎支原體感染極顯著影響豬的生長速度和肺組織病變。同時，本研究也檢測到血清抗體和免疫相關(guān)分子基因表達(dá)的變化。試驗結(jié)果表明成功建立F1(杜洛克×姜曲海)豬肺炎支原體感染模型。

圖4 試驗豬血清IgG的質(zhì)量濃度Fig.4 IgG mass concentrations in serum of experimental pigs

A. 感染組 Infection group;B. 對照組 Control group;“*”表示兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)，“**”表示兩組數(shù)據(jù)之間存在極顯著差異(P<0.01) “*” the difference between two sets of data at the ofP<0.05 ，“**” difference between two sets of data at the level ofP<0.01

圖5 試驗豬不同組織中IL-1β、TLR4、IL-4、IL-2基因的表達(dá)量
Fig.5 Gene expression ofIL-1β,TLR4,IL-4,IL-4in different tissue samples from experimental pigs

豬肺炎支原體感染通過改變或調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，造成病理變化，刺激宿主產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[12]。特異性抗體和 IgG 是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，在體內(nèi)廣泛分布，具有重要的免疫效應(yīng)，是機(jī)體抗感染的主力軍[4]。Jacobs等[13]研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠感染肺炎支原體后，IgG、IgA 質(zhì)量濃度和特異性抗體水平會顯著增加。鄧均華等[14]用肺炎支原體全菌抗原肌肉注射免疫試驗豬，2 周和 4 周后在試驗豬血清中均檢測到肺炎支原體抗體，并且肺炎支原體抗體水平與肺部感染嚴(yán)重程度相關(guān)。本試驗檢測到試驗豬在感染肺炎支原體后逐漸產(chǎn)生抗體，并且隨著持續(xù)感染，血清中肺炎支原體抗體和 IgG 質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)上升趨勢。試驗結(jié)果與已有報道基本一致，說明豬感染肺炎支原體后，機(jī)體通過免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體來抵抗肺炎支原體的感染。

病原體感染動物后，感染組織及相關(guān)免疫器官和組織會通過表達(dá)相關(guān)免疫分子來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[15]。在免疫反應(yīng)中，Toll 樣受體和炎性細(xì)胞因子起到關(guān)鍵作用[16]。TLR 4 屬于 TLR 家族，介導(dǎo)宿主對支原體脂蛋白的反應(yīng)，并在病原體識別、信號傳遞和先天免疫激活中發(fā)揮作用，刺激炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[5, 17]。IL-1β、IL-4、IL-2 是炎性細(xì)胞因子，在免疫器官和組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[18-19]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，細(xì)胞因子表達(dá)與豬支原體肺炎感染相關(guān)，方曉敏等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體強(qiáng)毒株刺激的豬肺部巨噬細(xì)胞TLR4、IL-1β均表現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)；Borjigin 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大白豬IL-4、IL-4和IL-10基因在肺門淋巴結(jié)的表達(dá)差異與肺炎支原體肺部病變存在相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，感染肺炎支原體試驗豬的肺組織和脾組織中IL-1β、IL-4、IL-2和TLR 4表達(dá)均顯著升高，表明這 4個免疫分子在抗肺炎支原體感染過程中發(fā)揮著作用，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究與探索。

脾臟是動物最大的外周免疫器官，當(dāng)動物受到病原體刺激后，成為產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子的重要場所[20- 21]，本研究發(fā)現(xiàn)，感染組脾組織中檢測到 4 個免疫相關(guān)基因均顯著表達(dá)，其中IL-1β、IL-4和IL-2基因極顯著表達(dá)，體現(xiàn)了脾臟在支原體感染中發(fā)揮重要免疫作用。肺臟是肺炎支原體感染的直接接觸組織，豬感染肺炎支原體后，大量中性粒細(xì)胞會聚集在肺泡組織中，進(jìn)行炎癥反應(yīng)。本研究在肺組織中檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β基因呈現(xiàn)極顯著表達(dá)。IL-1β是炎癥反應(yīng)的一個重要介質(zhì)，能夠誘導(dǎo)其他炎癥因子的釋放，促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)[22]。在肺組織中，IL-1β顯著激活巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子、趨化因子[18]。在本研究中，感染豬肺組織IL-1β顯著表達(dá)也體現(xiàn)IL-1β在豬感染肺炎支原體的炎癥反應(yīng)中的重要性。然而，在感染豬氣管組織中，均未檢測到4個免疫相關(guān)基因表達(dá)量的變化，這可能與氣管的特性有關(guān)，氣管并不是免疫器官，支原體感染未引起氣管組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過對F1(杜洛克×姜曲海)試驗豬接種感染肺炎支原體后的臨床癥狀、生長速度、肺組織病變、血清抗體水平及免疫相關(guān)分子基因的表達(dá)等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，成功構(gòu)建豬肺炎支原體感染模型，為進(jìn)一步研究對肺炎支原體耐受的杜洛克豬和易感的姜曲海豬的發(fā)病分子機(jī)理，并篩選支原體肺炎的抗病分子基因標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。