保育豬舍中豬源、糞源、氣源大腸桿菌的分離鑒定及16S rDNA同源性分析

郭慧慧，陳劍波，武守艷，程曉亮，韓文儒，韓一超

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032)

保育豬又稱為斷奶仔豬，是指28日齡左右斷奶后在保育豬舍中飼養(yǎng)到60～75日齡的仔豬[1]。大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli，E.coli)又稱為大腸桿菌，屬于埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌，廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體、空氣、水、糞便等中，其中致病性大腸桿菌可以引起斷奶仔豬腹瀉和斷奶仔豬水腫病，從而造成仔豬生長(zhǎng)發(fā)育不良甚至大規(guī)模死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。斷奶仔豬腹瀉常引起仔豬下痢、脫水；斷奶仔豬水腫病引起仔豬(如頭、腸胃系膜等部位)水腫和神經(jīng)癥狀(如共濟(jì)失調(diào)、震顫、后肢癱瘓等)；2種疾病在同一豬群可單獨(dú)發(fā)生也可同時(shí)發(fā)生，會(huì)造成仔豬死亡率升高[3-5]。目前，養(yǎng)殖場(chǎng)斷奶仔豬死亡很大比例是由感染致病性大腸桿菌所致，這是造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一，同時(shí)隨著臨床抗生素藥物的使用，致病性大腸桿菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，對(duì)于該病的防治也越來(lái)越嚴(yán)峻[6]。因此，本研究通過(guò)對(duì)常規(guī)養(yǎng)殖狀態(tài)下保育豬舍中豬源、糞源、氣源大腸桿菌進(jìn)行分離純化以及大腸桿菌16SrDNA基因全長(zhǎng)測(cè)序和同源性比較，尋找致病性大腸桿菌的來(lái)源，從而了解大腸桿菌在保育豬舍的流行情況，為有效切斷大腸桿菌病的傳播途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

于山西省介休市某規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)中，對(duì)單棟飼養(yǎng)量為500頭并有大腸桿菌病發(fā)生的半封閉保育豬舍1棟進(jìn)行為期21 d的檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)豬舍及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)豬舍類型為半封閉式，東西走向，南北縱墻有通風(fēng)小窗30個(gè)，小窗距離地面1.5 m，小窗面積為0.53 m×0.28 m。采用通風(fēng)系統(tǒng)，濕簾位于豬舍凈道端山墻。風(fēng)機(jī)位于污道端山墻上，分2層排列，每臺(tái)風(fēng)機(jī)功率相同，在試驗(yàn)階段每棟豬舍僅開(kāi)啟下排中間的1臺(tái)風(fēng)機(jī)，并采用時(shí)間與溫度雙重控制通風(fēng)系統(tǒng)(每棟豬舍通風(fēng)窗的開(kāi)啟位置相同，但略有偏差)。試驗(yàn)豬舍中間為1.0 m寬過(guò)道，兩側(cè)各13個(gè)豬欄(3.5 m×3.0 m)對(duì)稱分布，均采用乳頭式自動(dòng)飲水、自動(dòng)喂料，地溝式排糞(圖1)。仔豬從28日齡入舍到70日齡轉(zhuǎn)舍，飲水、喂料、光照、免疫等均執(zhí)行統(tǒng)一規(guī)定的程序。

圖1 保育豬舍結(jié)構(gòu)平視剖面圖(單位：m) Fig.1 Horizontal profile of the structure in weaning pig house (Unit: m)

1.3 主要試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂均購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；EXTaq酶、dNTP均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

Andersen-6級(jí)空氣微生物采樣器(型號(hào)為JWL-S6)購(gòu)自北京先能技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司；振蕩培養(yǎng)箱(型號(hào)為HZQ-F100)、空氣浴振蕩器(型號(hào)為HZQ-C)均購(gòu)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；離心機(jī)(型號(hào)為2-16PK)購(gòu)自Sigma公司；PCR儀(型號(hào)為PT-200)購(gòu)自BIO-RAD公司；電泳儀(型號(hào)為DYY-6C)購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.4 樣品采集

1.4.1 保育豬舍內(nèi)空氣樣品采集 設(shè)保育豬舍近濕簾端為始端第1組，分為南1和北1往風(fēng)機(jī)端依次自然數(shù)編號(hào)至最后一欄為南13和北13，選取南1、北1、南13、北13 四個(gè)豬欄中心以及整個(gè)豬舍中心位置(A、C、D、E、G)為5個(gè)采樣點(diǎn)[7](圖2)。選取天氣晴好的上午(11：00)用Andersen-6級(jí)微生物采樣器(內(nèi)置6個(gè)麥康凱培養(yǎng)皿)在每個(gè)采樣點(diǎn)的豬背高處(距離地面1.0 m)進(jìn)行空氣采樣。

1.4.2 保育豬舍內(nèi)糞便樣品采集 選取南1、北1、南7、北7、南13、北13共6個(gè)豬欄，在每個(gè)豬欄的排糞區(qū)中心位置附近，選取6個(gè)采樣點(diǎn)(A、B、C、E、F、G)(圖2)，選擇新鮮、無(wú)尿液等雜質(zhì)的糞便，撥開(kāi)表層，無(wú)菌采集內(nèi)部糞便1 g左右，裝入無(wú)菌管，用冰盒帶回并于24 h內(nèi)進(jìn)行處理。

A—G：采樣點(diǎn) A—G: Sampling point圖2 保育豬舍結(jié)構(gòu)與布點(diǎn)俯視剖面圖(單位：m) Fig.2 Overhead profile of the structure and stationing in weaning pig house (Unit: m)

1.4.3 豬鼻黏液樣品采集 選取南1、北1、南7、北7、南13、北13共6個(gè)豬欄，每個(gè)豬欄隨機(jī)選取1頭仔豬，用潔凈的醫(yī)用棉拭子，伸進(jìn)豬鼻腔內(nèi)沾取鼻腔分泌物，然后將棉拭子迅速裝入無(wú)菌管，用冰盒帶回并于24 h內(nèi)進(jìn)行處理。

1.4.4 病豬肺部組織樣品采集 選取該舍新發(fā)病(死)仔豬2頭，屠宰后采集肺部組織樣品。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品處理 豬的鼻腔黏液樣品：于無(wú)菌管中加1 mL生理鹽水，振蕩混勻，取100 μL液體，分別涂板營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基。

豬的糞便樣品：取樣品0.1 g左右，加200 μL生理鹽水稀釋，吹打混勻后分別涂板營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基。

病豬的肺組織樣品：剪開(kāi)外部肺組織，從中間無(wú)菌取0.1 g左右的肺組織，剪碎后加200 μL生理鹽水沖洗，吸取沖洗液分別涂板營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基。

1.5.2 大腸桿菌的分離與純化 將加樣品處理后的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用槍頭挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，得到純化的大腸桿菌個(gè)體。挑單菌落至1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃、18 r/min搖菌3～4 h。

1.5.316SrDNA基因的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定 使用細(xì)菌的16SrDNA基因通用引物27F和1492R，擴(kuò)增分離出的大腸桿菌16SrDNA基因全長(zhǎng)，將得到的菌液進(jìn)行PCR鑒定，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 500 bp左右，引物序列：上游引物5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和下游引物5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系為50.0 μL：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ExTaq酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠100 V 電泳40 min，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳完畢后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DNAStar軟件對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行16SrDNA基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似大腸桿菌的分離與培養(yǎng)

總共分離得到21株疑似大腸桿菌，包括舍內(nèi)空氣中12株、豬的糞便中3株、豬的鼻腔黏液中3株、發(fā)病豬的肺部組織中3株。在麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)后的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)基本一致，菌落大小均為2～4 mm，單個(gè)菌落呈紅色、圓形、扁平、濕潤(rùn)、光滑且邊緣整齊，可初步判定所分離得到的細(xì)菌為大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

由圖3可知，分離出的21株大腸桿菌擴(kuò)增出了1 500 bp左右的片段，與預(yù)期相符。

2.3 大腸桿菌16S rDNA基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及同源性分析

將分離的大腸桿菌16SrDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和同源性分析。由圖4和圖5可知，豬舍內(nèi)空氣環(huán)境(Aerosol-1、Aerosol-2、Aerosol-3)中的大腸桿菌與鼻腔黏液(Nasal-mucus)、病豬肺部組織(Lung)和糞便(Feces)中的大腸桿菌相似度分別為94.9%～96.3%、98.3%～99.1%、98.0%～99.2%。其中，豬糞便及病豬肺部組織中分離出的多株大腸桿菌同源性均大于99.0%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上屬于同一大分支由此可見(jiàn)它們屬于同種細(xì)菌，且親緣關(guān)系較近。

M：DL2000 DNA Marker；1—21:分離出的大腸桿菌16S rDNA全長(zhǎng)M：DL2000 DNA Marker；1—21: 16S rDNA of Escherichia coli圖3 分離的大腸桿菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA from isolated Escherichia coli

圖4 分離的大腸桿菌16S rDNA核苷酸序列同源性比對(duì) Fig.4 Homology alignment of 16S rDNA nucleotide sequence of isolated Escherichia coli

圖5 分離的大腸桿菌16S rDNA核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA nucleotide sequence of isolated Escherichia coli

3 結(jié)論與討論

本研究中，從保育豬舍內(nèi)空氣環(huán)境、豬糞便、豬鼻腔黏液和病豬肺部組織4種不同來(lái)源樣品分離到21株疑似大腸桿菌，培養(yǎng)鑒定和16SrDNA基因全長(zhǎng)測(cè)定表明，21株細(xì)菌均為大腸桿菌。計(jì)徐等[8]從保育豬舍中55日齡仔豬糞便中分離到了108株大腸桿菌。唐樹(shù)霄[9]在江蘇省于2011—2013年從臨診上疑似斷奶仔豬腹瀉或水腫病病豬的直腸棉拭以及病死豬的十二指腸共分離鑒定出228株大腸桿菌。

大腸桿菌是自然界普遍存在的一類細(xì)菌，除了存在于腸道正常菌群中的大腸桿菌對(duì)動(dòng)物有益外，其他各種血清型大腸桿菌均可誘導(dǎo)各種動(dòng)物感染發(fā)病[10-13]。仔豬斷奶后從分娩哺乳舍轉(zhuǎn)入保育舍，養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生改變，同時(shí)由母乳變?yōu)椴墒愁w粒飼料，環(huán)境和采食的改變均導(dǎo)致仔豬的易感性增強(qiáng)。如果豬舍環(huán)境惡劣，衛(wèi)生條件差，豬體的抗病力下降，豬只就會(huì)感染大腸桿菌，并發(fā)或繼發(fā)大腸桿菌病，嚴(yán)重影響集約化養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[14-16]。本研究中，病(死)仔豬肺部組織和糞便中的大腸桿菌與舍內(nèi)空氣中大腸桿菌同源性達(dá)到了98.0%以上，豬鼻腔黏液樣品中大腸桿菌與舍內(nèi)空氣中大腸桿菌的同源性達(dá)到了94.9%以上。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，舍內(nèi)空氣中的大腸桿菌和豬糞便中的大腸桿菌相似度最高，因此判定，糞源大腸桿菌是豬舍空氣環(huán)境中大腸桿菌的主要來(lái)源，推測(cè)原因可能是糞便不能被及時(shí)清理干凈，隨著動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和空氣流動(dòng)等將糞源大腸桿菌帶入到空氣環(huán)境，造成豬舍內(nèi)空氣環(huán)境污染，繼而引起豬只患病。

據(jù)報(bào)道，當(dāng)2株大腸桿菌16SrDNA基因的同源性達(dá)到99%以上時(shí)，可推斷2株菌為同種細(xì)菌；當(dāng)其16SrDNA基因的同源性為95%～99%時(shí)，可推斷2株大腸桿菌為同屬不同種；當(dāng)其16SrDNA基因的同源性小于95%時(shí)，2株大腸桿菌不同屬[17-19]。本研究中，分離的21株細(xì)菌之間同源性均大于94.9%，說(shuō)明它們?yōu)橥瑢偌?xì)菌，其中從病(死)仔豬肺部組織中分離出的大腸桿菌16SrDNA基因的同源性大于99.0%，病豬糞便中分離出的大腸桿菌同源性大于99.0%，說(shuō)明它們之間為同種細(xì)菌且親緣關(guān)系較近。保育豬舍內(nèi)空氣中的大腸桿菌與鼻腔黏液、糞便、病豬肺部組織中的大腸桿菌16SrDNA有很高的相似度。由此可見(jiàn)，豬舍內(nèi)空氣環(huán)境優(yōu)劣對(duì)豬只健康起著極為重要的作用。

本研究探明了糞源大腸桿菌為半封閉保育豬舍中致病性大腸桿菌的主要來(lái)源，是豬舍主要的潛在病原菌，為豬舍制定防疫機(jī)制提供了依據(jù)，對(duì)預(yù)防斷奶仔豬大腸桿菌病的發(fā)生具有重要的意義。