蛋內(nèi)注射黃芪多糖增強高溫孵化時雛雞法氏囊抗氧化性能

蘇蘭利，江海宙，趙銀利，王金榮，賈 葳，胡三龍

(河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001)

雛雞生長速度快、新陳代謝旺盛，但其散熱能力差，易發(fā)生熱應(yīng)激，這是導致雛雞發(fā)病和死亡的重要因素之一。胚胎時期熱習服是減輕雛雞熱應(yīng)激的有效方法，可使雛雞在后期的生長過程中獲得抵御熱應(yīng)激的能力，但高溫應(yīng)激會降低雛雞的抗氧化能力。有研究報道，在種蛋孵化的10～18胚齡時，每天對種蛋進行6 h的高溫處理，可以提高雛雞出生后對熱應(yīng)激的適應(yīng)能力，同時其生長速度也快于常溫孵化的雛雞[1-2]。但是高溫孵化會直接影響雞胚胎的發(fā)育，降低出雛率[3]。若母雞常處在高溫環(huán)境中，則會增加其種蛋的死胚率和后代的抗氧化能力[4]。

黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)具有抗炎和抗氧化等多種生物學特性[5]。有文獻報道，黃芪多糖可以提高動物谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)的含量[6-8]。在體外培養(yǎng)的雞淋巴細胞中加入黃芪多糖，能夠使雞淋巴細胞SOD和GSH-Px的活性顯著增強，使MDA含量降低[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，利用黃芪多糖浸泡種蛋，可以增強0日齡雛雞的脾臟和法氏囊指數(shù)，并增加雛雞肝臟、脾臟和法氏囊組織的抗氧化能力[10-11]。法氏囊是禽類的中樞免疫器官，有研究發(fā)現(xiàn)，高溫孵化后雛雞的生長指數(shù)及法氏囊質(zhì)量會顯著降低[12-13]。那么，黃芪多糖是否能夠緩解高溫孵化對雛雞法氏囊抗氧化能力和雞胚發(fā)育的抑制作用目前還不清楚。因此，本研究在入孵前對肉雞種蛋氣室內(nèi)注射不同劑量的黃芪多糖，然后進行高溫孵化，通過分析出雛后0、7日齡雛雞的體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，并進一步檢測雛雞血清和法氏囊組織中GSH-Px和SOD活性以及MDA含量，探討蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化雞胚發(fā)育和雛雞法氏囊抗氧化能力的影響，并尋找蛋內(nèi)注射黃芪多糖的最佳劑量，以期提高雛雞的抗熱應(yīng)激和抗病能力，并為黃芪多糖的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

黃芪多糖注射液購于北京生泰爾科技股份有限公司，規(guī)格為0.02 g/mL。GSH-Px試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒和考馬斯亮藍試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。孵化器購于南京萬盛孵化設(shè)備有限公司，酶標儀購于美國Bio-Tek公司。

1.2 肉雞種蛋的黃芪多糖注射和孵化

120枚固始肉雞種蛋購于河南農(nóng)業(yè)大學種雞場，按照種蛋質(zhì)量一致的原則隨機分為4個組，每組30枚。種蛋經(jīng)消毒后進行氣室內(nèi)注射黃芪多糖，對照組種蛋氣室內(nèi)注射1.5 mL生理鹽水，試驗1組、試驗2組、試驗3組分別注入0.5、1.0、1.5 mL黃芪多糖注射液，含黃芪多糖分別為10、20、30 mg。

將注射后的肉雞種蛋放入孵化器進行孵化，在1—9胚齡時將孵化器設(shè)置為溫度37.5 ℃、濕度60%。在孵化到10—18胚齡時，每天10:00將孵化器設(shè)置為溫度39.5 ℃、濕度60%，18:00將孵化器設(shè)置為溫度37.5 ℃、濕度60%，種蛋每天進行8 h的高溫孵化。孵化至19胚齡時落盤，直至出雛。

1.3 樣品采集及抗氧化指標測定

1.3.1 雛雞血樣及法氏囊的采集與處理 記錄出雛時的出雛數(shù)、健雛數(shù)、弱雛數(shù)，同時稱量雛雞體質(zhì)量。每組選取10只雛雞進行采血，解剖雞只后采集法氏囊并稱質(zhì)量，然后制備組織勻漿用于抗氧化指標測定。其余雛雞飼養(yǎng)至7日齡時稱量體質(zhì)量并進行采血，解剖雞只后采集法氏囊并稱質(zhì)量，然后制備組織勻漿用于抗氧化指標測定。

1.3.2 出雛指標及抗氧化指標的測定 出雛指標：出雛率=出雛數(shù)/種蛋數(shù)；健雛率=健雛數(shù)/雛雞數(shù)；弱雛率=弱雛數(shù)/雛雞數(shù)；法氏囊指數(shù)(mg/g)=法氏囊質(zhì)量(mg)/雛雞體質(zhì)量(g)。

抗氧化指標：血清和法氏囊組織中SOD活性測定采用羥胺法，GSH-Px活性測定采用比色法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，法氏囊組織勻漿蛋白質(zhì)含量測定用考馬斯亮藍法。具體測定均按照試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準誤”表示。所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的單因子方差分析進行統(tǒng)計，并進行LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化種蛋出雛的影響

如表1所示，分別在蛋內(nèi)注射10、20、30 mg黃芪多糖提高了經(jīng)高溫孵化后種蛋的出雛率和健雛率，降低了弱雛率。相比于對照組，試驗1、2、3組種蛋的出雛率分別提高了4.16%、4.16%、8.34%，健雛率分別提高了5.14%、7.05%、9.89%，因此，在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖的效果最好。

2.2 蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化雛雞法氏囊發(fā)育的影響

如表2所示，試驗3組0日齡雛雞的體質(zhì)量比試驗1組和對照組分別提高了4.83%和5.72%(P<0.05)，與試驗2組雛雞體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。試驗1組雛雞體質(zhì)量與試驗2組差異不顯著(P>0.05)。相比于對照組，試驗3組雛雞的法氏囊質(zhì)量提高了31.25%(P<0.05)，但與試驗1組和試驗2組雛雞的法氏囊質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。試驗組雛雞的法氏囊指數(shù)和對照組差異不顯著，說明在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖可以提高經(jīng)高溫孵化的0日齡雛雞的體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，對法氏囊指數(shù)沒有影響。

表1 種蛋出雛情況

表2 0日齡雛雞體質(zhì)量和法氏囊指數(shù)

注：字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Values with the same letter mean no significant difference (P>0.05), and values with different letter mean significant difference (P<0.05). The same below.

如表3所示，試驗1、2、3組7日齡雛雞體質(zhì)量分別比對照組提高了12.62%、14.83%和20.79%(P<0.05)，試驗3組雛雞的體質(zhì)量分別比試驗1組和試驗2組提高了7.25%(P<0.05)和5.19%(P>0.05)，試驗1組和試驗2組雛雞的體質(zhì)量之間差異不顯著(P>0.05)。試驗3組雛雞的法氏囊質(zhì)量分別比試驗1組和對照組提高了9.22%和29.12%(P<0.05)，與試驗2組沒有顯著差異(P>0.05)。試驗組雛雞的法氏囊指數(shù)和對照組差異不顯著(P>0.05)。說明在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖可以提高經(jīng)高溫孵化的7日齡雛雞體質(zhì)量，并促進法氏囊發(fā)育。

表3 7日齡雛雞體質(zhì)量和法氏囊指數(shù)

2.3 蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化雛雞血清抗氧化能力的影響

如表4所示，試驗2、3組0日齡雛雞的血清GSH-Px活性分別比對照組提高了40.30%、46.35%(P<0.05)，但與試驗1組差異不顯著(P>0.05)。此外，試驗1組雛雞的血清GSH-Px活性與對照組雛雞差異不顯著(P>0.05)。試驗1、2、3組雛雞的血清SOD活性分別比對照組雛雞提高了32.27%、35.76%、39.81%，達到差異顯著水平(P<0.05)，但3個試驗組之間差異沒有達到顯著水平(P>0.05)。試驗1、2、3組雛雞血清MDA含量分別比對照組降低了32.08%、44.94%、66.04%(P<0.05)，而試驗3組雛雞血清MDA含量分別比試驗1、2組降低了50.00%、38.32%(P<0.05)。說明在蛋內(nèi)注射黃芪多糖能夠顯著提高經(jīng)高溫孵化的0日齡雛雞的血清抗氧化能力，且有劑量依賴性，30 mg黃芪多糖效果最好。

表4 0日齡雛雞血清中抗氧化指標

如表5所示，試驗2、3組7日齡雛雞血清中GSH-Px的活性分別比對照組提高了32.96%、51.40%，SOD的活性分別比對照組提高了14.37%、21.22%(P<0.05)。試驗2、3組之間雛雞血清中GSH-Px和SOD的活性差異不顯著(P>0.05)。此外，試驗1、2、3組雛雞血清MDA含量分別比對照組降低了29.59%、54.59%、57.40%(P<0.05)，其中試驗2、3組雛雞血清MDA含量分別比試驗1組降低了35.51%、39.49%(P<0.05)，但試驗2組和試驗3組雛雞血清MDA含量之間差異不顯著(P>0.05)。說明在蛋內(nèi)注射20、30 mg黃芪多糖能夠顯著提高經(jīng)高溫孵化的7日齡雛雞的血清抗氧化能力。

表5 7日齡雛雞血清中抗氧化指標

2.4 蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化雛雞法氏囊抗氧化指標的影響

如表6所示，試驗3組0日齡雛雞法氏囊組織GSH-Px活性分別比對照組和試驗1組提高了33.65%和30.28%(P<0.05)，與試驗2組差異不顯著(P>0.05)。試驗1、2組雛雞法氏囊組織GSH-Px活性和對照組差異不顯著(P>0.05)。試驗2、3組雛雞法氏囊組織SOD活性分別比對照組提高了38.67%、49.93%(P<0.05)，但試驗2、3組雛雞法氏囊組織SOD活性之間差異不顯著(P>0.05)。試驗2、3組雛雞法氏囊組織MDA含量分別比對照組降低了37.21%、33.68%(P<0.05)，分別比試驗1組降低了30.68%、26.79%(P<0.05)，但試驗2、3組雛雞法氏囊組織MDA含量之間差異不顯著(P>0.05)。說明在蛋內(nèi)注射20、30 mg黃芪多糖能顯著提高經(jīng)高溫孵化的0日齡雛雞法氏囊組織抗氧化性能。

表6 0日齡雛雞法氏囊組織抗氧化指標

如表7所示，試驗3組7日齡雛雞法氏囊組織GSH-Px活性分別比對照組和試驗1組提高了24.46%和19.61%(P<0.05)；SOD的活性分別比對照組和試驗1組高出37.52%和31.50%(P<0.05)，與試驗2組差異不顯著(P>0.05)。試驗1、2組雛雞法氏囊組織GSH-Px和SOD活性與對照組均差異不顯著(P>0.05)。試驗2、3組雛雞法氏囊組織MDA含量分別比對照組降低了16.02%、23.12%(P<0.05)，但試驗2、3組雛雞法氏囊組織MDA含量之間差異不顯著(P>0.05)。說明在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖能夠顯著提高經(jīng)高溫孵化的7日齡雛雞法氏囊抗氧化性能。

表7 7日齡雛雞法氏囊組織抗氧化指標

3 結(jié)論與討論

3.1 蛋內(nèi)注射黃芪多糖對高溫孵化雛雞的雞胚和法氏囊發(fā)育的影響

溫度是種蛋孵化過程中的重要條件，會直接影響雞胚的發(fā)育。高溫孵化會抑制雞胚的發(fā)育，增加胚胎死亡率，降低雛雞體質(zhì)量[14-15]。黃芪多糖可以促進雞胚發(fā)育，增加雛雞質(zhì)量，提高出雛率[11]。本研究通過在種蛋氣室內(nèi)注射10、20、30 mg的黃芪多糖，使出雛率分別提高了4.16%、4.16%、8.34%，使健雛率分別提高了5.14%、7.05%、9.89%。因此，推測在蛋內(nèi)注射黃芪多糖能夠改善高溫條件下種蛋的孵化，且30 mg黃芪多糖效果最好。

法氏囊質(zhì)量和法氏囊指數(shù)是判斷法氏囊發(fā)育狀況的重要指標。高溫孵化會抑制雞胚的法氏囊發(fā)育，降低法氏囊質(zhì)量[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在種蛋內(nèi)分別注射10、20 mg黃芪多糖總體上對高溫孵化出的雛雞體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量沒有影響，注射30 mg黃芪多糖則能夠顯著提高高溫孵化出的0日齡和7日齡雛雞的體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，對法氏囊指數(shù)沒有影響，與前人研究的黃芪多糖能夠提高雞胚法氏囊質(zhì)量的結(jié)果一致[17,11]，同時也與本研究中，在蛋內(nèi)注射黃芪多糖能夠提高高溫孵化的種蛋出雛率和健雛率的結(jié)果相對應(yīng)。因此推測，在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖能夠緩解高溫孵化對雞胚和法氏囊發(fā)育的抑制作用，這種效應(yīng)能夠延續(xù)到雛雞7日齡。

3.2 蛋內(nèi)注射黃芪對高溫孵化時雛雞法氏囊抗氧化能力的影響

SOD和GSH-Px是動物體內(nèi)2種重要的抗氧化酶，能夠?qū)⒓毎玛惔x產(chǎn)生的超氧自由基轉(zhuǎn)化成無毒副作用的H2O，保護細胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。種蛋在孵化過程中溫度升高，雞胚心肌的抗氧化酶活性下降[18]。黃芪多糖是重要的抗氧化物質(zhì)[19-20]。飼料中添加黃芪多糖可以促進雛雞法氏囊和胸腺的發(fā)育，提高其血液中抗氧化酶的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在種蛋內(nèi)注射10 mg黃芪多糖能夠顯著提高0日齡雛雞血清中SOD活性，并降低MDA含量，但對0日齡雛雞法氏囊抗氧化酶活性沒有影響。在種蛋內(nèi)注射20、30 mg黃芪多糖能夠顯著增加高溫孵化時0日齡雛雞血清和法氏囊中抗氧化酶活性，并降低MDA含量，且30 mg效果比20 mg效果好，與先前研究的黃芪多糖浸泡種蛋能夠顯著增加0日齡雛雞血清和法氏囊組織GSH-Px和SOD活性，降低MDA含量結(jié)果一致[10-11]。

本研究結(jié)果還顯示，在蛋內(nèi)注射10 mg黃芪多糖對7日齡雛雞血清和法氏囊組織中的抗氧化酶活性沒有影響，在蛋內(nèi)注射20 mg黃芪多糖能夠顯著提高7日齡雛雞血清抗氧化酶活性，降低MDA含量，對法氏囊抗氧化酶活性沒有影響。在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖顯著提高7日齡雛雞血清和法氏囊抗氧化酶活性，降低MDA含量，與魏炳棟等[22]報道的黃芪多糖能夠提高肉仔雞生長前期的抗氧化能力一致，同時也與本研究中，在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖提高了7日齡雛雞體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量相對應(yīng)。因此推測，在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖能夠提高高溫孵化的雛雞血液和法氏囊組織抗氧化性能，這種效應(yīng)能持續(xù)到雛雞7日齡。

綜上所述，在蛋內(nèi)注射黃芪多糖促進雞胚的發(fā)育，減緩了由高溫孵化引起的出雛率和健雛率下降，降低了弱雛率。在蛋內(nèi)注射30 mg黃芪多糖能夠提高0日齡雛雞體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，緩解了高溫孵化對雞胚發(fā)育和法氏囊發(fā)育的抑制作用，且這種效應(yīng)持續(xù)到雛雞7日齡。在蛋內(nèi)注射20、30 mg黃芪多糖能夠緩解高溫孵化對0日齡雛雞血清和法氏囊抗氧化能力的抑制作用，但30 mg黃芪多糖的效果優(yōu)于20 mg，且注射30 mg黃芪多糖的效應(yīng)能夠持續(xù)到雛雞7日齡。