“探究pH對過氧化氫酶的影響”實驗改進

張 怡 王偉賢 姜若宏 陳文榮

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 浙江金華 321004）

“探究pH 對過氧化氫酶的影響”是浙科版高中生物學(xué)必修1“酶”中的實驗內(nèi)容。教材中的實驗設(shè)計是將浸過鮮肝勻漿的濾紙片貼在反應(yīng)小室內(nèi)上壁，分別加入不同pH 值的緩沖液及3%的H2O2溶液，并利用排水法觀察與反應(yīng)小室相連的量筒內(nèi)單位時間氧氣的釋放量［1］。

但在實際操作過程中，由于濾紙片易脫落，或在加入H2O2溶液時易與濾紙片接觸，從而使反應(yīng)提前進行。用排水法收集氣體對裝置的氣密性要求較高，實驗中需要一直扶著量筒保證位置不發(fā)生變化，極大增加了學(xué)生實驗操作的難度。為保證實驗的有效進行，目前已有不少一線教師對該項實驗裝置進行了改進。劉偉權(quán)［2］將裝置設(shè)計成由2支型號相同的注射器，取其中一支吸取一定量的H2O2溶液注射到貼有濾紙片的注射器中，觀察并記錄單位時間內(nèi)氣體的變化。然而，通過濾紙片浸過鮮肝勻漿的方法控制酶量，存在濾紙片大小、吸附能力無法統(tǒng)一的缺點，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)一定誤差［3］。因此，本文在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化了實驗方案，由2 支不同型號的注射器（20 mL 和1 mL）和一段硅膠管構(gòu)成，旨在為中學(xué)實驗“探究pH 對過氧化氫酶的影響” 提供一套操作簡便、成功率較高的實驗裝置。

1 材料與方法

1.1 材料 肝勻漿：菜市場購入新鮮豬肝，吸去表面血漬，稱重，按1∶10 的質(zhì)量體積比加入蒸餾水研磨充分，然后在4℃，4 000 r／min，離心10 min，取上清液即得肝勻漿。

1.2 試劑 3%的H2O2溶液，pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸鹽緩沖溶液（稱取10.68 g NaH2PO4·2H2O 和4.40 g Na2HPO4·12H2O 溶解定容到1 000 mL，配制成0.5 mol／L pH＝6.0 的磷酸鹽緩沖液，用NaH2PO4或Na2HPO4分別調(diào)pH 值為5.0、7.0、8.0）。

1.3 方法 使用20 mL 注射器（a）吸取1 mL 質(zhì)量分數(shù)為3%的H2O2溶液和1 mL pH＝5.0 的磷酸鹽緩沖溶液，使用1 mL 注射器（b）吸取0.2 mL肝勻漿，用硅膠管使2 支注射器相連，將b 注射器中的肝勻漿推入a 注射器中，推住b 注射器，使H2O2溶液與肝勻漿充分混合，準確記錄0.5 min、1.0 min、1.5 min 時a 注射器內(nèi)體積變化。以相同的方法分別測得pH 值分別為6.0、7.0、8.0 時的氧氣釋放量，每個pH 值重復(fù)測定3 次。用Excel統(tǒng)計各組結(jié)果，計算每組氧氣釋放量平均值和標準差，采用SPSS 軟件進行單因素方差分析比較不同處理間的差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對過氧化氫酶的影響 不同pH 值對過氧化氫酶催化H2O2溶液分解的速率影響不同。由表1可知，在pH＝5.0～8.0 范圍內(nèi)，隨著pH 值的上升，過氧化氫酶催化H2O2溶液的氧氣生成速率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，其中pH＝7.0時氧氣生成速率達到最大值，為4.1 mL／min。而在pH 值分別為5.0、6.0、8.0 時，過氧化氫酶催化H2O2溶液的氧氣生成速率都有所下降，分別為2.9 mL／min、3.5 mL／min、3.7 mL／min。由此可見，過氧化氫酶的活性在pH＝7.0 左右存在一個最適值，pH 值偏大或偏小都會降低過氧化氫酶的活性，從而限制H2O2溶液的氧氣生成速率。

表1 不同pH 值時過氧化氫酶催化3%的H2O2 溶液的氧氣釋放量

圖1 注射器內(nèi)1.5 min 時氧氣釋放量

2.2 實驗裝置改進后的優(yōu)勢 改進后的實驗裝置可以通過1 mL 注射器準確控制肝勻漿的用量，保證過氧化氫酶數(shù)量的統(tǒng)一，同時也避免了酶液提前與H2O2溶液發(fā)生反應(yīng)。再連接20 mL 注射器可以快速測得氧氣生成速率，從而間接比較不同pH值下過氧化氫酶的活性。實驗過程中學(xué)生無須一直扶著實驗裝置，可以解放雙手，更專注地觀察并記錄實驗現(xiàn)象。此外，實驗操作簡便，現(xiàn)象明顯，成功率較高，可以激發(fā)學(xué)生進行實驗探究的興趣。

3 結(jié)論與討論

“探究pH 對過氧化氫酶的影響”實驗中，實驗裝置的設(shè)計是關(guān)鍵。筆者在重復(fù)劉偉權(quán)的實驗方法時發(fā)現(xiàn)，2 支同為20 mL 注射器時，產(chǎn)生的壓力要遠大于1 mL 與20 mL 的組合。推住b 注射器的手需要用較大力，且持續(xù)1.5 min，這對于力量較小的學(xué)生來說，可能較為吃力。但若平放裝置，讀取并記錄2 支注射器活塞移動的空間大小之和，則會增大讀數(shù)誤差。改進后的實驗裝置，由1 mL 注射器控制過氧化氫酶的用量，1 mL 注射器的最小刻度為0.01 mL，可以較為準確地量取等量的肝勻漿，且相對于濾紙片更為客觀，有利于提高學(xué)生對酶反應(yīng)高效性的認識。而用濾紙片浸在豬肝研磨液中相同時間并取出適當晾干后，分別進行催化H2O2溶液分解，期間第1 片濾紙片與之后的濾紙片之間存在一定的時間誤差，可能會造成酶液的流失，影響實驗結(jié)果。實驗集氣裝置將教材中的量筒改為20 mL 的注射器，易于氧氣生成量的讀數(shù)。教材中量筒倒扣在水中，刻度線示數(shù)與正常測量時相反。學(xué)生在進行讀數(shù)時還需要扶著量筒保證位置不發(fā)生變化，這就會增加學(xué)生的讀數(shù)難度，無法保證視線始終與凹液面最低處相平，致使讀數(shù)偏大或偏小。改進后的實驗裝置僅由1 mL 和20 mL 注射器以及硅膠管組成，這些材料易獲得，教師開展該項實驗教學(xué)可不受時間地理的影響，值得推廣。

注射器氣量法作為一種簡易裝置，探究pH值對過氧化氫酶的影響有其一定的優(yōu)勢，但仍然存在問題。在記錄某一時刻的氧氣釋放量時，由于氣體生成速率較快，且不能隨時暫停反應(yīng)進程，這就需要學(xué)生快速準確地讀出注射器示數(shù)。筆者認為，可先用簽字筆在注射器的刻度線上做標記，待反應(yīng)完全結(jié)束后，再記錄示數(shù)。此外，在一次反應(yīng)結(jié)束后，需充分清洗注射器并用紙巾擦干，注意檢查注射器的氣密性是否良好，再準確吸取一定量的溶液。