EMS誘變對直立型扁蓿豆出苗和幼苗生長的影響

張雨桐，石鳳翎，喬雨，喬丹丹

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

扁蓿豆(MedicagoruthenicaL.)是苜蓿屬多年生豆科牧草，主要分布于我國東北、西部、西北的多個省區(qū)，該草種抗逆性強，莖葉柔軟，葉量大，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料〔1,2〕。扁蓿豆與苜蓿親緣關(guān)系較近，可作為苜蓿品種抗性改良及苜蓿新品種培育的重要種質(zhì)材料，但不足之處是其牧草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量均較苜蓿低〔3〕。直立型扁蓿豆[Medicagoruthenica( L.) Sojak.cv.Zhilixing]是1992年培育的扁蓿豆新品種，除具有飼用價值好、抗性強等優(yōu)良特性，相比野生型扁蓿豆還具有較高的草產(chǎn)量。在化學(xué)誘變中，EMS(甲基磺酸乙酯)是目前化學(xué)誘變效果中認(rèn)可度較高的誘變劑，且在植物誘變育種方面應(yīng)用相當(dāng)廣泛。EMS能誘發(fā)產(chǎn)生高密度的系列等位基因點突變，可避免由轉(zhuǎn)基因帶來潛在的安全性問題，因此是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中植物種質(zhì)創(chuàng)新的有效方法〔4-6〕。而對于EMS誘變直立型扁蓿豆產(chǎn)生新變異體的研究卻是很少。因此本試驗在喬雨等人〔7〕的研究基礎(chǔ)上，采用同一濃度(0.9%)的EMS溶液對直立型扁蓿豆2種萌發(fā)階段的種子處理不同時間，并測定其在誘變基礎(chǔ)上的成活率、生長指標(biāo)變化及其幼苗變異率，旨在明確直立型扁蓿豆幼苗最大變異率和較高成活率的EMS最適處理，以期獲得更多突變體材料，豐富直立型扁蓿豆牧草種質(zhì)資源，為苜蓿屬育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為直立型扁蓿豆[Medicagoruthenica( L.) Sojak.cv.Zhilixing]種子，2011年收獲于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗地，經(jīng)干燥處理后在4℃種子柜條件下貯藏。EMS 誘變劑(甲基磺酸乙酯)購于美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS處理吸脹種子方法

選取粒大飽滿的直立型扁蓿豆種子，用砂紙打磨以打破硬實，然后用蒸餾水預(yù)浸12h，使其達吸脹狀態(tài)。用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)配置濃度為0.0%、0.9%的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液。分別選取100粒種子置于100ml錐形瓶中，處理組加入0.9%EMS溶液50ml，對照(ck1)加50ml磷酸緩沖液，對照(ck2)加入50ml蒸餾水，其中1000粒用EMS處理，300粒用作對照ck1，300粒用作對照ck2。封口后將其置于20℃、60r/min的搖床中處理48h。以上處理劑量組合采用喬雨等以直立型扁蓿豆種子相對發(fā)芽率達半致死劑量下得到的時間和濃度〔5〕。處理后種子用蒸餾水沖洗4h，以去除殘留EMS。將各處理種子置培養(yǎng)皿中發(fā)芽，每皿100粒，每日按時觀察，待種子發(fā)芽后將其播種于育苗盤(基質(zhì)為1∶1∶1的沙土、蛭石、營養(yǎng)土的混合物)中，播種深度1～2cm，置于溫度為25℃、濕度為60%的人工智能溫室培養(yǎng)，培育期間水分供給一致。

1.2.2 EMS處理發(fā)芽種子方法

用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)配制0.9%EMS溶液。分別選取100粒發(fā)芽種子(胚根長為2～5mm)，置于100ml錐形瓶中，每一處理加入0.9%EMS溶液50ml，對照(ck1)加入50ml磷酸緩沖液，對照(ck2)加入50ml蒸餾水，封口后將其置于20℃、60r/min的搖床中分別處理1h、3h、5h。每組試驗3次重復(fù)，處理后的種子用流水沖洗30min，播種于育苗盤(基質(zhì)為1∶1∶1的沙土、蛭石、營養(yǎng)土的混合物)中，播種深度1～2cm，置于溫度為25℃、濕度為60%的人工智能溫室培養(yǎng)，培育期間水分供給一致。

1.2.3 測定指標(biāo)和方法

逐日記載EMS處理吸脹種子的發(fā)芽數(shù)，待連續(xù)2d無發(fā)芽則停止統(tǒng)計；EMS處理發(fā)芽種子播種后每隔4天觀察萌發(fā)情況(以子葉頂出土層5mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))，并統(tǒng)計各處理出苗數(shù)，計算相應(yīng)出苗率。20d計算相對出苗率，并隨機選取10株開始測量幼苗高度，之后每隔10d測量一次，連續(xù)測量5次，計算出各處理幼苗這60d內(nèi)的生長速度，取平均值。40d后計算成苗率和相對成苗率進行植株高度測定，同時統(tǒng)計葉片生長數(shù)目及第一片真葉及第二片真葉(中間小葉)長寬。并對幼苗的形態(tài)進行定期觀察，計算變異率。計算公式如下：

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

出苗率(%)=(出苗總數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

成苗率(%)=(成活苗總數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

相對出苗率(%)=(處理的出苗率/對照出苗率)×100%；

相對成苗率(%)=(處理的成苗率/對照成苗率)×100%；

變異率(%)=(變異株數(shù)/觀察株數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對吸脹種子萌發(fā)、出苗進程的影響

EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子對其種子萌發(fā)有抑制作用。由圖1可知，經(jīng)0.9%EMS處理48h的種子于第3d開始萌發(fā)，發(fā)芽率高峰出現(xiàn)在第4d，最終發(fā)芽率僅為8%；而對照ck1(磷酸緩沖液)和對照ck2(蒸餾水)處理吸脹種子分別在第3d、第2d開始萌發(fā)并達發(fā)芽率高峰，ck1最終發(fā)芽率為24.33%，ck2最終發(fā)芽率達64%。EMS處理發(fā)芽率顯著低于對照(ck1與ck2)(p<0.05)，ck1與ck2也具有顯著差異(p<0.05)。

圖1 0.9%EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子48h的發(fā)芽率情況

由表1可知，EMS相對ck1發(fā)芽率為37.75%，高于相對ck2發(fā)芽率(13.87%)；EMS相對ck1的出苗、成苗率分別為96%、66.47%，均高于ck2。EMS處理的發(fā)芽率相對CK1和CK2均在50%以下，即在半致死劑量以下其出苗率和成苗率均較低?？芍狢K1(磷酸緩沖液)也對種子的萌發(fā)、出苗和成苗產(chǎn)生一定程度的影響。

表1 EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子的相對萌發(fā)、出苗及成苗率

2.2 EMS處理對發(fā)芽種子出苗進程的影響

當(dāng)各處理出苗后，隨著生長會有部分幼苗枯萎死亡。圖2所示，當(dāng)EMS濃度一定時(0.9%)，隨著處理時間的增加，其相應(yīng)的出苗率均隨之降低；對照ck1(磷酸緩沖液)和對照ck2(蒸餾水)處理幼苗的出苗率存在顯著差異(p<0.05)，ck1在第13d前的觀測出苗率高于ck2，但在其之后ck1有明顯枯萎死亡現(xiàn)象，可知磷酸緩沖液對種子出苗有一定影響。0.9%EMS處理1h與ck1無顯著差異，其余處理與ck1有顯著差異(p<0.05)；而0.9%EMS處理1、3、5h均與ck2有顯著差異(p<0.05)。第4d時，ck1出苗率最高達40%，ck2出苗率為56%，EMS處理1h、3h的出苗率分別為30%，9.33%，EMS處理5h未有出苗。ck1、EMS處理1h和5h在第13d時達出苗高峰期，ck2和EMS處理3h在第16d時達出苗高峰期。播種16d后，ck1、1h、3h、5h的幼苗成活率相對穩(wěn)定，播種19d時ck2的幼苗成活率趨于穩(wěn)定。

圖2 0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子不同時間的出苗率情況

由表2可知，一定濃度的EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1h相對ck1的出苗率和成苗率有一定促進作用，其余處理時間對其均有抑制作用，且隨處理時間增加抑制作用增強；不同處理時間之間相對ck1出苗率均具有顯著差異(p<0.05)，而相對ck1的成苗率，0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1h與處理3h、5h有顯著差異，處理其3h與5h二者間無顯著差異(p<0.05)；0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子3h相對ck1的出苗率為52.55%，接近半致死劑量。一定濃度不同時間的EMS處理相對ck2的出苗率和成苗率均有抑制作用，并隨時間增長抑制效果加大；相對ck2的出苗率，同濃度不同處理時間間均有顯著差異；不同處理時間相對成苗率(ck2)間的差異顯著性與其相對ck1成苗率間一致。

表2 EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子的相對出苗及相對成苗率

注：同列具有完全不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表亦同。

2.3 EMS誘變對直立型扁蓿豆幼苗葉片生長的影響

由表3可知，經(jīng)EMS處理的直立型扁蓿豆吸脹種子播種成苗的第一片真葉長和寬均顯著低于對照(ck1和ck2)，ck1和ck2無顯著差異；EMS處理吸脹種子的第二片真葉的長與CK1無顯著差異，比ck2平均窄1.09mm，其間存在顯著差異(p<0.05)；EMS處理吸脹種子48h第二真葉寬與ck1和ck2均有顯著差異。EMS處理發(fā)芽種子5h的幼苗生長緩慢，40d時未長出第一片真葉，仍處于雙子葉期；EMS處理發(fā)芽種子的對照、1h處理的真葉長和寬分別比3h處理平均長3.94mm，2.27mm，且均與3h處理有顯著差異(p<0.05)；EMS處理發(fā)芽種子3h播種后幼苗的第二片真葉長、寬仍與ck1、ck2及處理1h有顯著差異，ck1與ck2間真葉長亦有顯著差異。

0.9%EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子48h幼苗生長40d時真葉數(shù)目與對照(ck1和ck2)有顯著差異(p<0.05)；EMS處理發(fā)芽種子3h與對照和1h平均少1-2片葉子，存在顯著差異(p<0.05)；EMS處理發(fā)芽種子的ck1葉片數(shù)目顯著少于ck2，可見磷酸緩沖液對葉片生長發(fā)育有一定抑制作用。

表3 EMS處理直立型扁蓿豆幼苗40d真葉長寬(mm)及數(shù)目

2.4 EMS誘變對直立型扁蓿豆幼苗高度及生長速度的變化

2.4.1 EMS誘變直立型扁蓿豆吸脹種子其幼苗高度及生長速度的變化

如圖3所示，EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子后生長的幼苗在第40d的株高顯著低于ck1、ck2的幼苗高(p<0.05)；ck1和ck2亦有顯著差異(p<0.05)，說明磷酸緩沖液抑制幼苗生長。如圖4所示，經(jīng)EMS處理吸脹種子的幼苗在第30d時生長速度與前期相比有明顯的提高，且第40d、50d及60d的生長速度整體較為穩(wěn)定；EMS處理60d內(nèi)的生長速度變化率較ck1和ck2均有所增加，其在第30d和40d時與ck1和ck2均有顯著差異，而在60d時只與ck2有顯著差異(p<0.05)；ck1和ck2在60d內(nèi)的生長變化率均無顯著差異。

圖3 第40天幼苗高度

圖4 60d內(nèi)幼苗生長速度變化

2.4.2 EMS誘變直立型扁蓿豆發(fā)芽種子其幼苗高度及生長速度的變化

如圖5所示，經(jīng)EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1h其幼苗高度在第40d時比對照偏高，說明一定濃度下短時間的EMS處理對幼苗生長有促進作用；3h處理的苗高顯著低于ck1、ck2和1h處理的苗高，可見在EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子3h對其生長有明顯抑制作用。如圖6所示，在幼苗生長的60d內(nèi)，處理1h、3h時其生長速度均呈先上升后下降的趨勢，都在40d時生長速度變化率最大，得知經(jīng)EMS處理的幼苗在20-40d生長最快；ck1在50d內(nèi)生長速度較為平穩(wěn)，第50-60d時幼苗生長緩慢；ck2在20-30d和40-50d時生長速度較快；處理3h在30d、40d、50d時生長速度與ck1、ck2、1h均無顯著差異，只在第60d時顯著低于ck2(p<0.05)，其余三者間無顯著差異。

圖5 第40天幼苗高度

圖6 60d內(nèi)幼苗生長速度變化

2.5 EMS誘變直立型扁蓿豆2種萌發(fā)階段種子對其變異率的影響

EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子和發(fā)芽種子的幼苗變異率、成活率如表4所示，從表4可以看出EMS處理對幼苗變異率產(chǎn)生一定影響。處理不同狀態(tài)種子其M1代幼苗在形態(tài)上表現(xiàn)各異，詳見圖7。EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子48h，其幼苗變異率為15.38%，成活率為43.3%；而EMS處理其發(fā)芽種子變異率和成活率相對較低，僅為5.29%和9.91%。由此可見，EMS誘變直立型扁蓿豆吸脹種子為較優(yōu)選擇。

表4 EMS處理幼苗的變異率和成活率

A-D為EMS處理吸脹種子幼苗形態(tài)變異，A.對照，B.葉量多，C.黃花葉，D.白化葉；a-d為EMS處理發(fā)芽種子幼苗形態(tài)變異，a.對照，b.生長抑制，c.第二片真葉變異，d.節(jié)間處變異。

圖7 苗期變異苗類型

3 討論

3.1 EMS處理直立型扁蓿豆2種萌發(fā)階段種子半致死劑量分析

在EMS誘變育種研究中，需選擇合適的誘變劑劑量，以獲得較好的誘變效應(yīng)〔8〕。EMS誘變一般以半致死劑量下的時間和濃度〔9-11〕。EMS誘變處理種子時，誘變濃度越高，處理時間越長，EMS越易溶解產(chǎn)生有機酸，毒害作用越強，會對種子產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。在何慧怡〔10〕等人研究發(fā)現(xiàn)在處理濃度相同的情況下延長處理時間的傷害要比處理時間相同增加處理濃度的傷害小，所以在選擇誘變處理組合的過程中應(yīng)從延長處理時間以提高誘變效率。本研究中，采用0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1、3、5h，以相對出苗率的50%為半致死劑量，處理發(fā)芽種子3h的相對出苗率為52.55%，接近半致死劑量。喬雨等〔5〕用0.9%EMS對直立型扁蓿豆吸脹種子處理48h，其相對發(fā)芽率為49.7%，達半致死劑量。而本試驗采用該劑量處理直立型扁蓿豆吸脹種子其相對發(fā)芽率僅達37.75%，分析其原因是可能與種子前期處理有關(guān)，砂紙打磨力度不同。

3.2 EMS誘變對幼苗外部形態(tài)特征的影響

EMS處理后幼苗外部形態(tài)特征的變化主要以形態(tài)學(xué)鑒定法來觀察，這是較為直觀的方法，在植株的整個生育期都可以用此方法進行判斷。夏曾潤等〔12〕對紫花苜蓿種子進行誘變，發(fā)現(xiàn)變異株株高與對照株相比變化顯著，變異株出現(xiàn)矮化，抑制生長等現(xiàn)象；臧輝等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)EMS誘變處理對羊草幼苗生長有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為根長、苗長的降低。云娜〔9〕研究得到長時間、高濃度EMS浸種對蒙農(nóng)紅豆草的幼苗生長有明顯抑制作用，低濃度的EMS浸種會在一定程度上促進苗高生長。本研究結(jié)果表明，0.9%EMS處理直立型扁蓿豆吸脹種子48h對其幼苗形態(tài)特征產(chǎn)生了一定的作用，其中經(jīng)處理后的幼苗生長速度整體高于對照，葉寬、葉長、真葉數(shù)及株高均比對照降低；0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1h對其幼苗生長有一定程度的促進作用，延長處理時間至3h其株高、葉長、葉寬則整體呈降低趨勢，并且在40-60d時生長速度明顯降低；本試驗結(jié)果與前人基本保持一致。利用形態(tài)學(xué)特征鑒定植物是否發(fā)生誘變的優(yōu)點是簡便、快速地便可在苗期做出篩選鑒定，大大減輕了育種者的工作量，但是其缺點是存在著很大的經(jīng)驗因素，所以鑒定結(jié)果一般僅作為初步判斷的結(jié)果，要得到比較準(zhǔn)確的結(jié)論還需進一步更深刻地進行后續(xù)階段突變體庫的建立及M2、M3代田間表型觀測及細(xì)胞學(xué)鑒定等。

3.3 EMS誘變對2種萌發(fā)階段種子誘導(dǎo)效率的影響

本試驗EMS處理發(fā)芽種子變異率為5.29%，成活率為9.91%，均低于EMS處理吸脹種子的變異率及成活率。邱慶樹等〔14〕研究中提到誘變發(fā)芽期種子，可提高其誘變效果；對于直立型扁蓿豆，李潔〔15〕采用秋水仙素處理直立型扁蓿豆不同萌發(fā)階段種子，研究發(fā)現(xiàn)處理胚根長至2-3mm的發(fā)芽種子誘導(dǎo)效果最好。這與本試驗所得結(jié)果存在差異，可能與誘變劑和處理方式有關(guān)。

3.4 磷酸緩沖液對幼苗生長的影響

前人EMS誘變處理多選用磷酸緩沖液作為對照〔7,9,12,16〕，本研究在EMS處理直立型扁蓿豆2種萌發(fā)階段種子均設(shè)立2個對照，即磷酸緩沖液對照和蒸餾水對照；研究結(jié)果顯示EMS處理吸脹種子的發(fā)芽率及其處理發(fā)芽種子的出苗率，磷酸緩沖液與蒸餾水均有顯著差異(p<0.05)；EMS處理發(fā)芽種子的2個對照在幼苗第二片真葉的長和真葉數(shù)上亦有顯著差異(p<0.05)；EMS誘變吸脹種子40d時磷酸緩沖液的幼苗高度顯著低于蒸餾水(p<0.05)。可見磷酸緩沖液對幼苗的萌發(fā)生長有一定程度的抑制作用。

4 結(jié)論

0.9%EMS分別處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子、吸脹種子48h和3h，其相應(yīng)幼苗的株高、葉長、葉寬、葉片數(shù)整體呈降低趨勢；而0.9%EMS處理直立型扁蓿豆發(fā)芽種子1h對其幼苗生長有一定程度的促進作用。以EMS半致死劑量下的時間和濃度處理直立型扁蓿豆吸脹種子的變異率、成活率均高于處理其發(fā)芽種子，EMS處理吸脹種子為更有效的誘變方式。磷酸緩沖液對幼苗生長有一定抑制作用。