杞菊地黃口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究Δ

周建華，洪挺，張昆艷，3，楊毅生#（1.江西青春康源中藥飲片有限公司，江西新余338000；.江西省藥品檢驗檢測研究院/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 33009；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

杞菊地黃口服液收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十一冊[1]，由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉八味中藥組成，具有滋腎養(yǎng)肝的功效，主要用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、羞明畏光、視物昏花[2]?，F(xiàn)行杞菊地黃口服液執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)簡單，只有高效液相色譜（HPLC）法測定芍藥苷的含量來控制牡丹皮一味藥材。然而，通過單一成分已經(jīng)很難控制復(fù)雜的成藥制劑的質(zhì)量，多組分的含量測定已成為趨勢，也更能反映成方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。但目前有關(guān)杞菊地黃口服液質(zhì)量控制方面的報道較少[3-6]。山茱萸（制）主要含環(huán)烯醚萜類化合物，具有補益肝腎、保護(hù)神經(jīng)等功效[7-8]，而馬錢苷和莫諾苷正是其中含量最高的環(huán)烯醚萜類化學(xué)成分；丹皮酚為牡丹皮主要活性性成分，具有抗菌消炎、保肝護(hù)腎等功效[9-10]。因此，本研究采用薄層色譜（TLC）法對杞菊地黃口服液中枸杞子、菊花、牡丹皮（以丹皮酚為對照）進(jìn)行定性鑒別研究[11-15]，并運用HPLC法測定其中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量[16-17]，使其質(zhì)量可控性更強，為綜合評價該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）和OpenLAB CDS Chem-Station工作站（美國安捷倫公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，十萬分之一）；KQ5200B型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（德國默克密理博公司）。

1.2 藥品與試劑

杞菊地黃口服液（江西濟民可信藥業(yè)有限公司，批號：180101，規(guī)格：10 mL，無糖型）；杞菊地黃口服液（江西廣恩和藥業(yè)股份有限公司，批號：Q180501，規(guī)格：10 mL）；杞菊地黃口服液（北京華潤高科天然藥物有限公司，批號：24301801，規(guī)格：10 mL）；枸杞子對照藥材（批號：121072-201611）、菊花對照藥材（批號：121384-201504）、莫諾苷對照品（批號：111998-201703，純度：97.4%）、馬錢苷對照品（批號：111640-201707，純度：99.2%）、丹皮酚對照品（批號：110708-201407，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層色譜板（青島海洋化工有限公司，200～300目）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1 枸杞子的TLC鑒別 取本品20 mL，置于分液漏斗中，分別用乙酸乙酯振搖提取2次（每次30 mL），合并上層的乙酸乙酯層，水浴蒸干，所得殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材0.5 g，置于圓底燒瓶中，加水40 mL，置電熱套中加熱回流15 min，放冷，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按杞菊地黃口服液處方和工藝制備缺枸杞子的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502法進(jìn)行試驗[18]，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各5μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光主斑點，且陰性對照無干擾。枸杞子的TLC鑒別圖見圖1。

圖1 枸杞子的TLC鑒別圖Fig 1 TLC chromatograms of the fruit of C.wolfberry

2.1.2 菊花的TLC鑒別 取“2.1”項下的供試品溶液作為本研究的供試品溶液。另取菊花對照藥材1 g，置于圓底燒瓶中，加水20 mL，置電熱套中加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按杞菊地黃口服液處方和工藝制備缺菊花的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502法進(jìn)行試驗[18]，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-異丙醇-甲酸（10∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，且陰性對照無干擾。菊花的TLC鑒別圖見圖2。

2.1.3 牡丹皮的TLC鑒別 取本品20 mL，用石油醚（60～90℃）振搖提取2次（均為20 mL），合并上層石油醚液，自然揮干，所得殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹皮酚對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按杞菊地黃口服液處方和工藝制備缺牡丹皮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502法進(jìn)行試驗[18]，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性5%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。牡丹皮的TLC鑒別圖見圖3。

圖2 菊花的TLC鑒別圖Fig 2 TLC chromatograms of D.morifolium

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.03%磷酸溶液（B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：莫諾苷和馬錢苷檢測波長為240 nm，丹皮酚檢測波長為274 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedures

2.2.2 溶液的制備 混合對照品溶液：分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品10.90、9.64、23.94 mg，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為21.23、19.13、47.83μg/mL的混合對照品溶液，即得。供試品溶液：精密量取本品2 mL，置于25 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性對照溶液：按杞菊地黃口服液處方和工藝制備缺山茱萸（制）和牡丹皮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

圖3 牡丹皮的TLC鑒別圖Fig 3 TLC chromatograms of P.suffruticosa

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，理論板數(shù)按莫諾苷和馬錢苷峰計都不低于4 000，基線分離度良好，相鄰峰間分離度均大于1.5，色譜圖見圖4。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品適量，用50%甲醇制成莫諾苷質(zhì)量濃度分別為2.12、4.25、21.23、42.47、106.17 μg/mL，馬錢苷質(zhì)量濃度分別為1.91、3.83、19.13、38.25、95.63 μg/mL，丹皮酚質(zhì)量濃度分別為4.78、9.57、47.83、95.66、239.16 μg/mL的系列混合對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。分別以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，線性關(guān)系見表2。

表2 線性關(guān)系與定量限、檢測限結(jié)果Tab 2 Linear relationships，quantitation limits and detection limits

2.2.5 檢測限與定量限考察 精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按比例稀釋，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10∶1時計算定量限，信噪比為3∶1時計算檢出檢測限，結(jié)果見表2。

圖4HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.24%、0.42%、0.47%（n＝6），表明儀器具有較好的精密度。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取杞菊地黃口服液樣品（批號：180101）適量，共6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚峰含量的平均值分別為0.23、0.10、0.05 mg/mL，RSD分別為1.79%、0.03%、0.81%（n＝6），表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（樣品批號：180101）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h后按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.46%、0.32%、0.28%（n＝6），說明供試品溶液中3種成分均在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液（樣品批號：180101）適量，共6份，每份1 mL，分別置于25 mL量瓶中，再精密加入混合對照品溶液5 mL（莫諾苷0.053 1 mg/mL、馬錢苷0.028 7 mg/mL和丹皮酚0.012 0 mg/mL），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的平均回收率分別為98.27%、97.06%、97.65%，RSD分別為0.80%、1.18%、1.36%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.10 耐用性試驗 取本品照“3.1”項下方法試驗，分別用InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、YMC-Pack ODS-A C18（200 mm×4.6 mm，5μm）3種品牌的色譜柱按正文中的色譜條件對樣品中莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的含量進(jìn)行測定，計算結(jié)果顯示使用3種品牌色譜柱測定結(jié)果無明顯差別，耐用性良好，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的RSD分別為0.05%、0.04%、1.16%（n＝3）。

2.2.11 樣品含量測定 分別取杞菊地黃口服液（批號：分別為180101、Q180501、24301801），每個樣品取3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并計算3種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 杞菊地黃口服液中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚含量測定結(jié)果（n＝3，mg/mL）Tab 3 Results of content determination of morroniside，loganin and paeonol in Qiju dihuang oral liquid（n＝3，mg/mL）

3 討論

杞菊地黃口服液由八味藥材組成，成分復(fù)雜，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)又過于簡單，因此通過建立TLC鑒別方法來控制樣品質(zhì)量就顯得十分有必要。本研究建立了枸杞子、菊花、牡丹皮的TLC鑒別方法。試驗結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點，且陰性對照無干擾。在方法學(xué)研究中，筆者考察比較了采用自制板和預(yù)制板以及在不同溫度、不同濕度下的展開情況，結(jié)果表明色譜斑點與分離度均符合要求，耐用性良好。此外，本課題組還分別摸索了熟地黃、山藥、茯苓、澤瀉藥材的TLC鑒別方法，但與各自陰性對照都存在干擾，故未能將其TLC鑒別方法列入標(biāo)準(zhǔn)中。

原標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項下以芍藥苷為指標(biāo)來控制牡丹皮的質(zhì)量，但根據(jù)制劑制備工藝，牡丹皮有揮發(fā)油提取過程，通過芍藥苷含量變化并不能體現(xiàn)制劑工藝中揮發(fā)油提取過程，而牡丹皮中另一揮發(fā)性藥效成分丹皮酚，通過控制其含量可以體現(xiàn)牡丹皮揮發(fā)油的提取工藝；馬錢苷和莫諾苷為山茱萸專屬性成分，且具有保肝益腎等生物活性[7-8]，故本研究建立了莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的含量測定方法。

在檢測波長選擇上，采用DAD檢測器對莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，莫諾苷和馬錢苷在240 nm、丹皮酚在274 nm波長處有最大吸收且雜峰對目標(biāo)峰干擾少。在供試品溶液制備中，分別考察了甲醇、50%甲醇、乙醇為稀釋溶劑，結(jié)果顯示，以乙醇為稀釋溶劑時測得的3種成分的含量最低，以50%甲醇為稀釋溶劑時測得的莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚含量均最高，可能是50%甲醇對目標(biāo)化合物溶解性最好；另外還考察了10、25、50倍稀釋倍數(shù)，結(jié)果顯示稀釋25倍時供試品溶液中色譜峰型最佳，故最終選擇50%甲醇、定容至25 mL為最佳供試品溶液制備最佳條件。在色譜條件選擇上，筆者摸索了乙腈（甲醇）-水、乙腈（甲醇）-0.3%磷酸溶液按一定比例混合作為流動相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)磷酸的加入對目標(biāo)峰拖尾有很大程度的改善，有機相為乙腈時雜質(zhì)峰明顯變少，基線更平穩(wěn)且與其余峰分離較好，故最終以乙腈-0.3%磷酸溶液為流動相；其他條件不變，改變柱溫（25、35、40℃），結(jié)果柱溫為40℃時供試品色譜圖中目標(biāo)峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，符合測定條件。

綜上所述，本研究建立的TLC法和HPLC法操作簡便、耐用性好、專屬性強，可以定性和定量反映杞菊地黃口服液的內(nèi)在質(zhì)量，為其臨床用藥安全提供保證。