超聲輔助酶解法提取杠板歸中總黃酮*

張道英，孫湘婷，鐘 亮，朱浩文，黃 浩

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

杠板歸別名眾多，又稱貫葉蓼、河白草、犁頭藤等，為蓼科植物杠板歸的莖葉部分，夏季開花時(shí)采收，曬干而成，拉丁學(xué)名為PolygonumperfoliatumL.[1-2]。藥材表面呈紫紅色或紫棕色，莖細(xì)長(zhǎng)呈方柱形，直徑約0.1～0.2 cm；莖有棱，棱及葉柄有倒生鉤刺；葉互生，有長(zhǎng)柄，葉片多皺縮，展平后呈三角形狀，為蓼科蓼屬一年生攀緣草本植物[2]，在全國(guó)各地均有分布。根據(jù)古代本草醫(yī)書上記載，杠板歸味酸苦，入肺、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕消腫、治蛇咬傷、活血散瘀等功效。在民間杠板歸的單方用藥常用于治療濕疹、癰腫疔瘡、帶狀皰疹、瘰疬、水腫脹、腎炎水腫、蛇蟲咬傷等，療效顯著[3]。藥理研究表明，杠板歸的提取液具有保肝、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等活性作用[3-4]。

研究表明杠板歸中含有多種黃酮類成分，黃酮類化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)中間通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[5]。這些成分具有明顯的藥理活性[6-9]。目前，杠板歸中總黃酮的提取工藝研究只限于纖維素酶解法[10]、回流提取法、超聲提取法和微波萃取法[11]，還沒有纖維素酶輔助提取工藝與多種提取法聯(lián)合提取工藝的相關(guān)研究。超聲波能夠通過空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，并通過熱效應(yīng)加速藥材有效成分溶出，從而使提取溶劑溶解更多藥材細(xì)胞內(nèi)的有效化學(xué)成分[12],而纖維素酶能夠使植物細(xì)胞壁中的纖維素分解，進(jìn)而增加細(xì)胞壁的通透性，同樣能增加藥材細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的溶出[13]。本文聯(lián)用纖維素酶解法和超聲提取法提取杠板歸中總黃酮，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲輔助酶解法的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化后與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行對(duì)比，為杠板歸中總黃酮的提取工藝研究及聯(lián)用多種提取法提取植物中有效成分提供良好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑蘆丁(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201408，純度90.2%)，95%乙醇(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，亞硝酸鈉(分析純)，硝酸鋁(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，纖維素酶(≥15 U·mg-1，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，杠板歸(2015、2016年分別采自四川省樂山縣，經(jīng)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李加林副教授鑒定為杠板歸正品)。

1.2儀器XL-600B小寶多功能粉碎機(jī)(永康市小寶電器有限公司)，藥典三號(hào)篩(孔徑0.355 mm，浙江上虞市道墟張興紗篩廠)，F(xiàn)A1104萬分之一電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒—托利多集團(tuán))，紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)珀金埃爾默公司)，JP-100超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)，HH-S24四顯雙列四孔恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)，Satorious PB-10酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯貿(mào)易有限公司)。

1.3方法

1.3.1樣品前處理取適量杠板歸藥材，曬干、粉碎，過藥典三號(hào)篩，干燥后放入干燥密封袋中備用。2015年、2016年四川產(chǎn)杠板歸均粉碎，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)選用2015年四川產(chǎn)杠板歸粉末。

1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品約0.02 g至小燒杯中，加入60%乙醇使對(duì)照品充分溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并用10 mL同濃度的乙醇潤(rùn)洗兩次燒杯，洗滌液并入容量瓶中，定容，制得0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL、12.00 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加入60%乙醇使其容量瓶?jī)?nèi)液體均為12 mL，再分別加入1.0 mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；再加入1.0 mL濃度為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min；再加入10.0 mL濃度為4%的NaOH溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻后靜置10 min[14-15]。以試劑空白作參比，在510 nm處測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3超聲提取法與回流提取法的比較采用朱良榮等[11]探索的超聲提取法提取杠板歸總黃酮的最佳提取條件：精密稱取干燥杠板歸粗粉約1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入40 mL 60%乙醇溶液，在40 ℃環(huán)境下超聲提取40 min。提取后趁熱抽濾，用60%乙醇溶液10 mL洗滌濾渣2次，將濾液與洗滌液合并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，定容，混勻。精密移取提取液1 mL至25 mL容量瓶中，按“1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下自“加入60%乙醇使其容量瓶?jī)?nèi)液體均為12 mL”起，依法進(jìn)行吸光度測(cè)定。

另外精密稱取干燥杠板歸粗粉約1.0 g，置于100 mL蒸餾燒瓶中，以上述超聲提取法的料液比及乙醇濃度為提取條件，在恒溫85 ℃水浴中醇提2 h，靜置冷卻，過濾。濾渣同樣按上述方法用10 mL 60%乙醇溶液洗滌2次，合并提取液并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中。移取提取液1 mL至25 mL容量瓶中，測(cè)定吸光度。

1.3.4酶法輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)考察根據(jù)“1.3.3超聲提取法與回流提取法的比較”的結(jié)果確定使用超聲提取法或回流提取法提取杠板歸中的總黃酮，并輔助酶法進(jìn)行提取，對(duì)酶法提取的酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH值等條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察，確定杠板歸中總黃酮的最佳提取條件。

1.3.4.1酶濃度分別精密稱取約1.0 g杠板歸粗粉，置于5個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，取40 mL 60%乙醇溶液，用纖維素酶調(diào)溶液酶濃度分別為0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1后加入到燒瓶中，再用酸度計(jì)調(diào)節(jié)溶液pH值均為5.0。放入恒溫水浴鍋中，設(shè)定溫度為45 ℃，酶解90 min。酶解完成后，將圓底燒瓶取出，并用沸水水浴5 min做酶滅活處理。之后將蒸餾燒瓶放入超聲儀中超聲40 min，取出，按“1.3.3”中操作進(jìn)行抽濾、定容、吸光度測(cè)量等處理。

1.3.4.2酶解時(shí)間分別精密稱取約1.0 g干燥杠板歸粗粉，置于5個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，取40 mL 60%乙醇溶液，調(diào)節(jié)溶液酶濃度為“1.3.4.1酶濃度”優(yōu)選出的最佳濃度后加入到燒瓶中，調(diào)節(jié)pH為5.0，放入溫度設(shè)定為45 ℃的恒溫水浴鍋中，設(shè)置酶解時(shí)間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。進(jìn)行酶滅活處理后超聲40 min，取出，按“1.3.3”中操作進(jìn)行抽濾、定容、吸光度測(cè)量等處理。

1.3.4.3酶解溫度分別精密稱取約1.0 g干燥杠板歸粗粉，置于5個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，取40 mL 60%乙醇溶液，調(diào)節(jié)溶液酶濃度為“1.3.4.1酶濃度”優(yōu)選出的最佳濃度后加入到燒瓶中，調(diào)節(jié)pH為5.0，分別在溫度設(shè)置為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)酶解，酶解時(shí)間為“1.3.4.2酶解時(shí)間”優(yōu)選出的最佳酶解時(shí)間。進(jìn)行酶滅活處理后超聲40 min，取出，按“1.3.3”中操作進(jìn)行抽濾、定容、吸光度測(cè)量等處理。

1.3.4.4酶解pH值分別精密稱取約1.0 g干燥杠板歸粗粉末，置于5個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，取40 mL 60%乙醇溶液，調(diào)節(jié)溶液酶濃度為“1.3.4.1酶濃度”優(yōu)選出的最佳濃度后加入到燒瓶中，分別調(diào)節(jié)pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，放入溫度設(shè)置為“1.3.4.3酶解溫度”優(yōu)選出的最佳溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)酶解，酶解時(shí)間為“1.3.4.2 酶解時(shí)間”優(yōu)選出的最佳提取時(shí)間。進(jìn)行酶滅活處理后超聲40 min，取出，按“1.3.3”中操作進(jìn)行抽濾、定容、吸光度測(cè)量等處理。

1.3.5酶法輔助提取的正交試驗(yàn)考察根據(jù)“1.3.4 酶法輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)考察”的結(jié)果對(duì)酶法提取的條件進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，確定杠板歸中總黃酮的最佳提取工藝。

1.3.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分別精密稱取約1.0 g的2015年四川產(chǎn)干燥杠板歸粗粉3份和2016年四川產(chǎn)干燥杠板歸粗粉3份，置于6個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，用上一步優(yōu)選出的最佳提取工藝進(jìn)行超聲輔助酶解法提取杠板歸中的總黃酮，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回收方程為Y=10.27X+0.007 2(Y為吸光度A，X為濃度，單位為mg·mL-1)，R2=0.999。結(jié)果表明蘆丁在濃度為0～0.096 mg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2超聲提取法與回流提取法的結(jié)果比較用超聲提取法提取得到杠板歸中總黃酮的提取率為2.17%，用回流提取法提取得到杠板歸中總黃酮的提取率為1.97%。超聲提取法提取杠板歸中總黃酮提取率比回流提取法提高了10.2%，故本實(shí)驗(yàn)采取超聲輔助酶解法提取杠板歸中總黃酮。

2.3超聲輔助酶解法單因素試驗(yàn)的結(jié)果

2.3.1酶濃度不同纖維素酶濃度相對(duì)應(yīng)的杠板歸中總黃酮的提取率如圖1所示：在酶濃度為0.1～0.3 mg·mL-1時(shí)，杠板歸中總黃酮的提取率隨酶解反應(yīng)中纖維素酶濃度的增加而明顯提高。在酶濃度為0.3 mg·mL-1時(shí)，該法提取率達(dá)到最大值3.80%，但繼續(xù)增加纖維素酶濃度，提取率開始降低并趨于平衡。分析原因可能是由于纖維素酶與底物濃度已經(jīng)達(dá)到飽和，進(jìn)一步增加酶濃度反而導(dǎo)致酶量過多，造成酶的蓄積，增加了傳質(zhì)阻力[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)物酶濃度為0.3 mg·mL-1。

圖1 超聲輔助酶解法中纖維素酶濃度對(duì)提取率的影響趨勢(shì)圖

2.3.2酶解時(shí)間不同酶解時(shí)間相對(duì)應(yīng)的杠板歸中總黃酮的提取率如圖2所示：杠板歸總黃酮提取率隨酶解時(shí)間的增加而提高，在酶解時(shí)間為90 min時(shí)，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間總黃酮提取率幾乎不變。該結(jié)果表明酶解90 min時(shí)，蒸餾燒瓶中杠板歸中總黃酮已經(jīng)提取完全，杠板歸中總黃酮提取的最佳酶解時(shí)間為90 min。

圖2 超聲輔助酶解法中酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響趨勢(shì)圖

2.3.3酶解溫度不同酶解溫度相對(duì)應(yīng)的杠板歸中總黃酮的提取率如圖3所示：在酶解溫度為35 ℃～45 ℃，杠板歸總黃酮提取率明顯隨溫度的增高而提高。當(dāng)酶解溫度到達(dá)45 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高值3.80%，之后再升高酶解溫度總黃酮提取率反而降低。分析原因可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致纖維素酶構(gòu)型發(fā)生改變，酶活性降低；也可能是因?yàn)闇囟瘸^50 ℃時(shí)杠板歸中溶出的黃酮類化合物易發(fā)生氧化反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而無法與顯色劑反應(yīng)，因而提取率下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杠板歸中總黃酮提取的最佳酶解溫度為45 ℃。

圖3 超聲輔助酶解法中酶解溫度對(duì)提取率的影響趨勢(shì)圖

2.3.4酶解pH值不同酶解pH相對(duì)應(yīng)的杠板歸中總黃酮的提取率如圖4所示：在pH為5.0時(shí)，超聲輔助纖維素酶法提取杠板歸中總黃酮的得率達(dá)到最大值3.80%，表明在此pH下，纖維素酶的活性達(dá)到最大，酸度過大或者堿性過強(qiáng)都會(huì)使其纖維素酶的活性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杠板歸中總黃酮提取的最佳酶解pH值為5.0。

圖4 超聲輔助酶解法中酶解pH值對(duì)提取率的影響趨勢(shì)圖

2.3.5單因素實(shí)驗(yàn)小結(jié)通過單因素實(shí)驗(yàn)考察，得出超聲輔助酶法提取杠板歸中總黃酮時(shí)酶解法的最佳條件為：纖維素酶濃度0.3 mg·mL-1、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0，在該條件下進(jìn)行提取杠板歸中總黃酮的提取率為3.80%。

為了進(jìn)一步優(yōu)化超聲輔助酶解法的提取工藝，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)其最佳提取工藝進(jìn)行探究。

2.4正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.4.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)探究結(jié)果，以杠板歸中總黃酮提取率為考察對(duì)象，選定超聲輔助酶解法中纖維素酶濃度、酶解pH值、酶解溫度以及酶解時(shí)間為4個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)來優(yōu)化超聲輔助酶解法提取杠板歸中總黃酮的提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素水平見表1。正交試驗(yàn)結(jié)果用軟件正交設(shè)計(jì)助手ⅡⅤ3.1專業(yè)版分析，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析據(jù)表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中極差值R分析，4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素影響超聲輔助酶解法提取杠板歸中總黃酮的提取率的程度如下：C(酶解溫度)>B(酶解pH)>D(酶解時(shí)間)>A(酶解濃度)。再綜合各種因素的K值分析，超聲輔助纖維素酶法提取杠板歸中總黃酮的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件組合是C3B2D2A1，即酶解溫度為50 ℃，酶解pH為5.0，酶解時(shí)間為90 min，纖維素酶濃度為0.2 mg·mL-1，在該條件下測(cè)定的杠板歸中總黃酮得率為3.88%，相比傳統(tǒng)乙醇回流提取法提高了97.0%，比單獨(dú)使用超聲提取法提高了78.8%。

2.5超聲輔助酶解法提取杠板歸中總黃酮的最佳提取工藝通過單因素實(shí)驗(yàn)并結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選出超聲輔助酶法提取杠板歸中總黃酮的最佳工藝為：精密稱取干燥杠板歸粗粉約1.0 g，置于100 mL的圓底燒瓶中，取40 mL 60%乙醇溶液，調(diào)節(jié)溶液酶濃度為0.20 mg·mL-1后加入到燒瓶中，再用酸度計(jì)調(diào)節(jié)溶液pH值為5.0，放入溫度設(shè)定為50 ℃的恒溫水浴鍋中，酶解90 min。酶解完成后，將圓底燒瓶取出，并用沸水水浴5 min做酶滅活處理。之后將蒸餾燒瓶放入超聲儀內(nèi)超聲40 min。提取后趁熱抽濾，用60%乙醇溶液10 mL洗滌濾渣2次，將濾液與洗滌液合并，即得。

2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及不同批次樣品比較

2.6.1驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分別精密稱取約1.0 g的2015年四川產(chǎn)干燥杠板歸粗粉，置于3個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，在最佳提取工藝條件下進(jìn)行超聲輔助酶解法提取總黃酮，平均提取率為3.90%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示。表明通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中各組杠板歸總黃酮提取率

2.6.2不同批次樣品比較分別精密稱取約0.5 g的2016年四川產(chǎn)干燥杠板歸粗粉置于3個(gè)100 mL的圓底燒瓶中，同樣在最佳提取工藝條件下進(jìn)行超聲輔助酶解法提取杠板歸中的總黃酮，得出2016年產(chǎn)杠板歸中總黃酮的平均提取率為9.00%。見表4。

表4 2016年四川產(chǎn)杠板歸總黃酮提取率

與“2.6.1驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)”中2015年四川產(chǎn)杠板歸中總黃酮提取率相比較，2016年四川產(chǎn)杠板歸中總黃酮量明顯高于2015年四川產(chǎn)杠板歸，分析原因可能是2016年四川產(chǎn)杠板歸本身總黃酮量較高，而2015年四川產(chǎn)杠板歸含量較低，且2015年四川產(chǎn)杠板歸在保存過程因保存不當(dāng)，導(dǎo)致大量黃酮類化合物流失或者被氧化，所以含量較2016年四川主杠板歸的含量低。

3 討 論

朱良榮等[11]探究出的最佳超聲提取條件為選用濃度為60%的乙醇，以1∶15料液比，在40 ℃環(huán)境下超聲40 min。本實(shí)驗(yàn)是在該最佳提取條件下，采用纖維素酶解法聯(lián)合超聲提取法提取杠板歸中總黃酮，主要探究其工藝中的最佳酶解條件及其工藝可行性，所以在實(shí)驗(yàn)中固定超聲時(shí)間為40 min，并選用濃度為60%的乙醇進(jìn)行提取。但實(shí)驗(yàn)采用料液比固定為1∶40，與參考文獻(xiàn)[17]不同，原因是：在進(jìn)行提取過程中，采用1∶15的料液比，發(fā)現(xiàn)乙醇溶液無法浸沒杠板歸粉末，這樣容易導(dǎo)致提取不完全，得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不具有可靠性；另外在朱良榮等[11]文獻(xiàn)中料液比作為一個(gè)單因素所對(duì)應(yīng)的極差R值較小，且進(jìn)行方差分析后發(fā)現(xiàn)料液比對(duì)提取率的影響不顯著，而且理論上擴(kuò)大料液只會(huì)增加提取率或?qū)μ崛÷视绊懖淮螅虼吮緦?shí)驗(yàn)綜合考慮采用1∶40料液比進(jìn)行提取。

本文比較2015年和2016年四川產(chǎn)杠板歸粉末的總黃酮含量，旨在了解不同年份的杠板歸藥材中總黃酮含量差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明年份更久杠板歸藥材總黃酮含量更低。在杠板歸藥材儲(chǔ)藏過程中，由于微生物或空氣氧化等原因，藥材中的有效成分會(huì)大量流失，因此在臨床上選用杠板歸入藥時(shí)，應(yīng)盡可能選擇年份較近的杠板歸。