Maspin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

孫 茜，李 煥綜述，陳龍邦審校

0 引 言

乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（mammary serine protease inhibitor，Maspin）是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，Serpin）超家族中的一員。Maspin在多種腫瘤中表達，越來越多的證據(jù)表明，Maspin基因在腫瘤的發(fā)生、進展中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)Maspin作為Ⅱ類抑癌基因可誘導腫瘤細胞凋亡，減少腫瘤細胞的運動及增加黏附能力來抑制腫瘤的侵襲和轉移，還可直接誘導內皮細胞凋亡及抑制內皮細胞生成信號通路來抑制腫瘤內新生血管的形成。Maspin具有廣泛的抗腫瘤作用，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)Maspin與宿主免疫相關。本文將對Maspin的結構部分，腫瘤抑制作用的發(fā)揮機制等作一綜述。

1 Maspin的結構與分布

Maspin是Zou等［1］1994年通過消減雜交法和差異顯示分析技術，在比較正常乳腺組織與乳腺癌組織基因差異表達時發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤抑制基因。Maspin屬于Serpin超家族一員，也被稱為SerpinB5，位于染色體18q21.3-q23區(qū)，由7個外顯子和6個內含子組成，具有375個氨基酸，其cDNA包含2548個核苷酸，其中75個5’端氨基酸和1381個3’端未翻譯氨基酸，其內有8個半胱氨酸組成2個及以上二硫鍵以穩(wěn)定三級結構。Maspin的-COOH端附近有一個活性點環(huán)（reactivesiteloop，RSL），活性中心的NH 2有一鉸鏈區(qū)，該區(qū)域在Serpin家族中高度保守，決定與之結合的特定靶點。RSL的完整性與Maspin的功能發(fā)揮密切相關［1］。敲除Maspin后的小鼠是胚胎致死的，體現(xiàn)了其不能被家族其他成員補償或替代的重要生物學功能［2-3］。多種實驗條件下測定了Maspin的幾個靶點，包括組蛋白脫乙酰酶1（HDAC1），前尿激酶型纖溶酶原激活物（pro-uPA），單鏈組織型纖溶酶原激活劑（SC-TPA）。此外，干擾素調節(jié)因子6、β1整合素、膠原蛋白I和谷胱甘肽S-轉移酶被鑒定為Maspin相關蛋白［4］。Maspin是一種上皮特異性基因，在許多類型包括前列腺、乳腺和肺等實體腫瘤的發(fā)展過程中受到不同的調節(jié)［5］。Maspin基因表達在胰，膽囊、結腸癌、甲狀腺癌中上調［6-7］，但在乳腺癌，前列腺癌、肺癌、胃癌和黑素瘤、口腔癌、食管癌中下調［6-9］。Maspin無特定的亞細胞定位序列的模體，目前發(fā)現(xiàn)有4種Maspin，分別是核型，細胞質性，細胞膜相關型的和分泌型［5］。因此，Maspin的腫瘤抑制功能及其分子相互作用可能取決于其亞細胞定位。最近的研究表明，細胞核Maspin與分化良好的表型和存活率提高有關，而細胞質Maspin與乳腺癌、卵巢癌和頭頸癌、肺癌的不良預后有關［10-13］；也有研究發(fā)現(xiàn)在黑色瘤中，核maspin與疾病進展、復發(fā)及不良預后有關［14］。Maspin的亞細胞定位從細胞核易位到細胞質中與腫瘤進展有關。

2 Maspin的腫瘤抑制作用

目前研究發(fā)現(xiàn)Maspin是腫瘤抑制基因，可通過誘導凋亡、抑制腫瘤細胞遷移和運動、抑制新生血管的形成來發(fā)揮腫瘤抑制作用。見圖1。

圖1 Maspin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制Figure 1 The mechanism of maspin in tumor formation and progression

2.1 Maspin誘導凋亡作用Maspin是迄今為止在凋亡調控中涉及的所有Serpin超家族成員中唯一的促凋亡Serpin。Maspin可通過增強細胞對凋亡刺激的敏感性來抑制腫瘤進展，且Bax在Maspin的促凋亡作用中發(fā)揮重要作用。Liu等［15］發(fā)現(xiàn)Bax在Maspin轉染的前列腺和乳腺腫瘤細胞中上調，而其他Bcl-2家族成員包括Bcl-2，Bcl-xl和Bak的水平則保持不變。但Zhang等［16］發(fā)現(xiàn)Maspin過表達的小鼠模型中促凋亡蛋白Bax水平上升的同時，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低，且該現(xiàn)象不受轉錄水平的控制，而是通過選擇性的控制Bcl-2和Bax蛋白穩(wěn)定性實現(xiàn)。細胞凋亡誘導后，Maspin轉染的前列腺癌細胞中有更多量的Bax從細胞質轉移到線粒體，且在用Bax沉默的小干擾RNA處理后，Maspin轉染的前列腺癌細胞對藥物誘導的細胞凋亡更敏感。另外轉染Maspin的前列腺癌細胞經(jīng)凋亡誘導劑處理后，細胞中的Caspase-8和9的活化增加［15］。E2F1轉錄因子是腫瘤抑制因子RB的關鍵下游靶標。E2F1被激活時后可誘導細胞增殖和/或凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Maspin可作為E2F1調節(jié)基因而誘導凋亡［17］。研究者利用DNA微陣列的方法分別分析了經(jīng)過E2F1激動劑和細胞毒性藥物處理的人骨肉瘤細胞株中的基因譜，發(fā)現(xiàn)了Maspin的表達增加，并且聯(lián)合用藥時Maspin的表達增加更顯著。在小干擾RNA處理E2F1后，Maspin的水平下降。然而，當在用小干擾RNA處理Maspin之后，發(fā)現(xiàn)E2F1激動劑聯(lián)合細胞毒性化療藥處理的細胞株的凋亡水平下降，在獨立試驗中也發(fā)現(xiàn)了相同的結果，表明Maspin是E2F1促進凋亡的必要因子。Gan等［18］發(fā)現(xiàn)Maspin可通過PTEN/Maspin途徑調節(jié)前列癌的紫杉醇耐藥，PTEN的過表達可引起細胞凋亡，PTEN對紫杉醇誘導細胞凋亡的促凋亡效應可通過敲除Maspin來消除?；贛aspin可增強細胞對凋亡刺激更敏感的特點，對Maspin在增加腫瘤對化療藥物敏感進行了相關研究。Jiang等［19］發(fā)現(xiàn)導入Maspin后，乳腺癌細胞對星形環(huán)孢素誘導細胞凋亡的敏感度增加；Ben等［17］發(fā)現(xiàn)Maspin可通過增強E2F誘導的凋亡來增加骨肉瘤細胞對多西他賽和順鉑的敏感性；Chen等［20］發(fā)現(xiàn)Maspin可增加膀胱癌細胞對順鉑的敏感性，同時發(fā)現(xiàn)轉染Maspin后，癌細胞的凋亡增加。

2.2 抑制腫瘤細胞侵襲和轉移Maspin可抑制腫瘤的侵襲和轉移，其作用部位在細胞膜上，當用重組Maspin處理乳腺癌細胞時，通過免疫染色顯示Maspin蛋白質特異性結合于細胞表面，表明Maspin活性是膜相關的［21］。G-螺旋是Maspin抑制細胞遷移和改變細胞粘附的關鍵部位，其通過影響細胞表面的β1整合素的活化狀態(tài)來發(fā)揮作用［22］。Maspin能抑制前列腺癌細胞中的細胞表面結合尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase plasminogen aetivator，uPA）［23］。uPA是一種絲氨酸蛋白酶同時也是纖溶系統(tǒng)的重要組成部分，通過與細胞表面的uPA受體結合，降解細胞外基質、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、板層素、蛋白多糖等基膜成分，促進細胞浸潤及轉移。在轉染Maspin的前列腺癌細胞中，uPA及其受體蛋白顯著降低，但mRNA的水平不受影響。酶和分子分析顯示Maspin通過與細胞表面的uPA形成SDS抗性復合物來抑制細胞表面的纖溶酶原激活。Maspin對細胞周圍uPA活性的影響可能是其在細胞黏附步驟中的刺激作用及其對細胞侵襲和運動的抑制作用的基礎［23-24］。Rho GTPases通過對肌動-肌球蛋白細胞骨架進行調控而影響細胞移動，有研究發(fā)現(xiàn)Maspin可通過調節(jié)Rho GTPase尤其是Rac1和其效應物PAK1活性來抑制細胞運動，并通過PI3K/ERK途徑促進細胞粘附［25］。轉染Maspin的乳腺癌細胞的細胞運動力下降，并在轉染Maspin的12-24h后發(fā)現(xiàn)Rac1和PAK1的活性也是下降的，說明Maspin可通過抑制Rac1抑制細胞運動。PI3K/ERK通路參與了黏附因子所介導的細胞黏附、運動和侵襲作用，在乳腺癌細胞經(jīng)重組Maspin處理后的1h內觀察到了PI3K和ERK1/2活性增加，在12h后恢復基線水平，同時觀察到了細胞黏附性下降30%。作者還發(fā)現(xiàn)了PI3K信號不影響Rac的活性，經(jīng)PI3K抑制劑處理過的重組Maspin的乳腺癌細胞后，發(fā)現(xiàn)Rac的活性下降程度與未加抑制劑一樣。除改變腫瘤細胞的運動及黏附能力，Maspin還可通過逆轉上皮-間質轉化抑制腫瘤的侵襲和轉移。Cai等［26］發(fā)現(xiàn)Maspin可抑制上皮生長因子誘導的上皮-間質轉化，將Maspin導入經(jīng)表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）誘導的上皮-間質轉化的食管癌細胞模型中，發(fā)現(xiàn)相比親代和空載細胞系接受EGF刺激后細胞形態(tài)從上皮樣轉化為紡錘樣，Maspin轉染的癌細胞仍呈聚集狀態(tài)，并且Mapsin轉染細胞的侵襲和轉移能力更低。Bernardo等［4］發(fā)現(xiàn)Maspin可通過一系列的時間和空間上的過程驅動前列腺癌細胞的再分化，這可逆轉上皮-間質轉化。

2.3 抑制新生血管形成血管生成，指從先前存在的毛細血管中形成新的血管，對腫瘤的生長和轉移是至關重要的。Maspin可通過抑制新生血管的形成發(fā)揮腫瘤抑制作用。體外試驗中，Maspin基因能夠直接抑制培養(yǎng)基中血管內皮細胞向堿性纖維生長因子和血管內皮生長因子的運動，抑制有絲分裂和血管生成。在將轉染Maspin基因的人前列腺腫瘤細胞接種小鼠后，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長速度明顯減慢，且腫瘤微血管的密度明顯減少。Maspin的RSL的突變使其失去了抑制纖維母細胞，角化細胞和乳腺癌細胞遷移的能力，但仍然能夠阻止體外和體內的血管生成［27］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，Maspin可直接誘導血管內皮細胞凋亡，在含乳腺癌細胞的異種移植小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Maspin可誘導新生內皮細胞凋亡，干擾腫瘤新生血管的形成，而不影響正常成熟的血管內皮細胞［28］。突變p53和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與血管生成有關，而Maspin是一種強有力的血管生成抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)Maspin的P53調控，抑制VEGF引起的內皮刺激［29］。野生型P53參與多種生物過程，其中包括抑制血管生成，突變型則與血管生成相關；Zou等［30］在乳腺癌及前列腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，P53可直接結合到Maspin啟動子中的P53共識結合位點來激活Maspin啟動子。研究發(fā)現(xiàn)在早期口腔癌中，Maspin與突變型P53及VEGF呈負相關，但突變型P53與VEGF呈正相關，于是假設P53調控Maspin表達，Maspin抑制VEGF生成（P53-Maspin-VEGF），從而抑制血管生成［26］。Bolat等［31］發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者中的Maspin的表達與 VEGF-A（P=0.01）、VEGF-C（P＜0.001）、VEGF-D（P＜0.001）的表達相關，且Maspin、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的表達與腫瘤的不良預后有關。有88.3%（53/60）的卵巢癌樣本的Maspin僅在細胞質中表達，11.7%（7/60）的樣本的Maspin在細胞質和細胞核中均有表達［31］，這些結果說明Maspin的亞細胞定位與其功能發(fā)揮腫瘤血管抑制作用有關。另外Qin等［32］發(fā)現(xiàn)體外試驗中，Maspin通過整合信號β1通路調節(jié)內皮細胞黏附和遷移，Maspin在血管和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中表達。HUVECs中的Maspin能激活整合素連接激酶，增強HUVEC細胞粘附在各種基質蛋白上的能力，抑制血管形成。

3 Maspin與免疫

既往關于Maspin的研究主要集中于其腫瘤抑制作用，關于免疫方面的研究相對較少。Dzinic等［33］發(fā)現(xiàn)Maspin與腫瘤宿主免疫有關，攜帶Maspin表達含前列腺癌細胞的無胸腺小鼠模型中，全身及腫瘤內中性粒細胞成熟、活化和抗體依賴性細胞毒性增加，而腫瘤周圍淋巴管生成減少。這些結果揭示了Maspin在增強宿主免疫、抗腫瘤方面的新生物學功能，即腫瘤細胞中的Maspin表達能引發(fā)中性粒細胞和B細胞依賴性宿主腫瘤免疫原性。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中最常見的免疫細胞并影響腫瘤發(fā)生的每一步。最近的研究發(fā)現(xiàn)Maspin可抑制巨噬細胞的吞噬作用，并增加炎性細胞因子的產(chǎn)生［34］；Maspin的這個作用是通過激活NF-κB信號通路發(fā)揮的。Maspin刺激后，巨噬細胞中的IL-1β，TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-12，IL-10，and M1樣標記物（M1樣巨噬細胞發(fā)揮抗腫瘤作用）增多，而TGF-β、M2樣標記物（促腫瘤作用）減少。Western試驗發(fā)現(xiàn)Maspin刺激的巨噬細胞中NF-κB的表達上升，阻斷NF-κB后，巨噬細胞的吞噬作用得到恢復。Yang等［35］通過2D凝膠電泳分離了結腸癌患者的癌組織及正常組織的蛋白質，并用患者的自身血清抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)了170種僅在癌組織中表達的血清抗體反應蛋白，其中有包括Maspin在內的4種蛋白重復表達；在跨越結腸癌的各種臨床階段的8名患者的驗證組中通過蛋白質印跡和免疫組織化學獨立地證實這4種蛋白質在癌組織中相對于正常組織呈過度表達。這些結果揭示了Maspin作為腫瘤抑制基因發(fā)揮著依賴于微環(huán)境的新的生物功能，可能為基于Maspin的腫瘤免疫治療開辟一條新的途徑。

4 結 語

Maspin是一種表皮特異性的腫瘤抑制基因，其細胞亞定位與其功能發(fā)揮相關，Maspin可誘導凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和新生血管形成，進而影響腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展，最近的研究發(fā)現(xiàn)Maspin還與宿主免疫相關。由于Maspin的廣泛抗腫瘤作用，對Maspin的監(jiān)測、評價及應用有望成為惡性腫瘤的預后預測因子或治療手段。