HPLC-MS/MS測(cè)定生乳中L-羥脯氨酸的不確定度評(píng)定

康 寧 郭麗麗 劉曉琳 花 錦 高利珍

(1.太原理工大學(xué)，山西 太原 030024；2.中華人民共和國(guó)太原海關(guān)，山西 太原 030024；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619)

在2008年爆發(fā)的三聚氰胺事件后，不少不法商販又將目光轉(zhuǎn)向動(dòng)物水解蛋白，代替三聚氰胺加入到乳及乳制品中以增加乳中蛋白含量。L-羥脯氨酸是動(dòng)物水解蛋白的特征成分[1]，乳蛋白質(zhì)中不含有，它是膠原蛋白中特有的一種氨基酸，約占膠原蛋白氨基酸總量的10%，而膠原蛋白的主要來(lái)源是動(dòng)物皮料。曾有無(wú)良商家向乳制品中摻雜以皮革下腳料等原料制備低廉的高蛋白產(chǎn)品，由于此類低廉的高蛋白產(chǎn)品存在鉻殘留，長(zhǎng)期食用此類低廉高蛋白產(chǎn)品的乳制品會(huì)危害人體健康[2-3]。2011年中國(guó)食品安全整頓工作辦公室發(fā)布關(guān)于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第五批)》的通知(整頓辦函〔2011〕1號(hào))中明確皮革水解物不能加入乳制品中[4]。

目前，乳及乳制品中L-羥脯氨酸主要是采用分光光度法和液相色譜及質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)[4-6]，經(jīng)檢索對(duì)于各類食品檢測(cè)方法的不確定度研究報(bào)告較多[7-9]，而L-羥脯氨酸的不確定度評(píng)估卻較少[10-11]，尤其是L-羥脯氨酸在乳及乳制品中檢測(cè)方法的不確定度評(píng)估，只有1篇關(guān)于分光光度法的不確定度研究[12]，對(duì)于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)質(zhì)量的保證是很關(guān)鍵的，其次作為第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)在日常檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)乳及乳制品中L-羥脯氨酸檢測(cè)送檢率較高，因此對(duì)于L-羥脯氨酸的質(zhì)譜檢測(cè)方法的不確定度亟待評(píng)估。

基于SN/T 3929—2014《出口食品中L-羥脯氨酸的測(cè)定》，本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定生乳中L-羥脯氨酸測(cè)量的不確定進(jìn)行評(píng)定，以期為結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保證，為客戶提供公平公正的檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生乳：散裝，委托送檢樣品；

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度(99±1)%，上海古朵生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

優(yōu)級(jí)純、正己烷、鹽酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

甲酸銨：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters ACQUITY TQ Detector型，美國(guó)沃特世公司；

電子分析天平：Mettler ME204E型，瑞士梅特勒集團(tuán)；

冷凍干燥機(jī)：Scientz-18N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

漩渦混勻器：TALBOYS DIGITAL VRTX MXR 230V EURO型，美國(guó)Henry Troemner公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Heating Bath B-491型，瑞士步琪(Buchi)實(shí)驗(yàn)室儀器公司；

超聲波清洗器：KQ-500DB型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確移取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述1 mLL-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容到10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于4 ℃下保存。再移取0.003，0.005，0.010，0.020，0.050 mLL-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液分別置于10 mL容量瓶中，再用水定容成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品制備 準(zhǔn)確稱取生乳1 g于30 mL水解管中，移取6 mol/L鹽酸溶液10 mL，混合后充入氮?dú)夥饪?，?05 ℃下水解過(guò)夜。將水解液冷卻過(guò)濾，并用25 mL 水稀釋后-80 ℃冷凍干燥2 h，凍干物依次加1 mL 水，10 mL 乙腈，溶解。將提取液40 ℃進(jìn)行減壓濃縮干，并用1 mL乙腈—水(9+1體積比)溶解。溶解液用5 mL乙腈飽和正己烷液液分配、萃取脫脂，下層溶液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，待上機(jī)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent HILIC(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.01 mol/L的甲酸銨溶液和乙腈；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.4 羥脯氨酸測(cè)量的數(shù)學(xué)模型

(1)

式中：

X——樣品中L-羥脯氨酸的含量，μg/kg；

c——溶液中L-羥脯氨酸在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的濃度，ng/mL；

V1——提取液的體積，mL；

V2——用于凈化樣品的體積，mL；

V3——樣品的最終定容體積，mL；

1 000——換算系數(shù)；

m——樣品的質(zhì)量，g；

f(rec)——回收率的校正因子；

f(rep)——重復(fù)性的校正因子。

2 分析過(guò)程中不確定度的分量

通過(guò)提取、凈化、濃縮、定容生乳中的L-羥脯氨酸等步驟，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)引入不確定度。每個(gè)步驟對(duì)應(yīng)的不確定度較為困難，本文選擇評(píng)價(jià)了檢測(cè)方法中數(shù)據(jù)的分量。

圖1 生乳中L-羥脯氨酸測(cè)定不確定度來(lái)源圖Figure 1 Uncertainty sources of determination for L-hydroxyproline in raw milk

2.1 質(zhì)量引入的不確定度

稱取樣品0.518 5 g，由電子天平的計(jì)量證書(shū)獲得，稱量范圍為0～100 g，示值誤差為±0.000 1 g，取矩形分布，稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 樣品前處理中體積引入的不確定度

2.2.1 水解溶液定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 JJG 196-2006《常用玻璃量器》檢定規(guī)程中規(guī)定A級(jí)10 mL具塞比色管的容量允差為±0.002 0 mL，取矩形分布，則得出10 mL具塞比色管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 水解溶液分取體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 2.5 mL分取體積需使用5 000 μL的移液器，JJG 646-2006《移液器》檢定規(guī)程中規(guī)定：5 000 μL移液器取2 500 μL時(shí)的容量允差為±0.5%，取矩形分布，則得出水解液分取體積引入的不確定度為：

2.2.3 最終定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 本方法定容體積為1 mL，JJG 646-2006《移液器》檢定規(guī)程中規(guī)定：1 000 μL 移液器的容量允差為±1.0%，取矩形分布，則得出最終定容體積引入的不確定度為：

由前處理中體積引入的不確定度為：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程的不確定度

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)上標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度urel(P)=0.000 25。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程的不確定度 使用0.1 mg 的分量天平、A級(jí)10 mL的容量瓶稱取標(biāo)準(zhǔn)品、配制和稀釋，JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中規(guī)定A級(jí)10 mL容量瓶最大允許差為±0.025 mL，因此由容量瓶引入的不確定度為：

2.3.3L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度 配制質(zhì)量濃度為30，50，100，200，500 ng/mL的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度只與儀器的靈敏度相關(guān)。L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。

根據(jù)式(2)、(3)計(jì)算L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。

圖2 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 2 L-hydroxyproline standard curve

(2)

(3)

式中：

urel(C)——L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度；

SA——回歸直線標(biāo)準(zhǔn)偏差；

Ai——i個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)定的峰面積；

R——按回歸方程計(jì)算得出的i點(diǎn)的峰面積；

N——標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)。

經(jīng)計(jì)算得urel(C)=0.053 6。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度不確定度的合成

2.4 回收率帶入的不確定度

對(duì)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，需要添加6次相同濃度的標(biāo)樣，測(cè)得回收率分別為94.3%，98.1%，97.8%，92.7%，99.9%，99.2%，平均回收率97.0%，根據(jù)式(4)、(5)計(jì)算回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(4)

(5)

式中：

urel(frec)——回收率引入的不確定度；

n——回收率測(cè)定的頻次點(diǎn)。

2.5 重復(fù)性帶入的不確定度

選取一個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)，L-羥脯氨酸測(cè)得結(jié)果為374.351 2，375.463 5，375.631 3，375.785 6，374.379 9，375.129 5 μg/kg，平均值為375.123 5 μg/kg，根據(jù)式(4)、(5)計(jì)算重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度：urel(frep)=0.033 83。

2.6 合成最終的不確定度

通過(guò)對(duì)方法重復(fù)性及數(shù)學(xué)模型的每個(gè)分量引入的不確定度等分量進(jìn)行合成，最終通過(guò)計(jì)算合成不確定度：

urel(X)=

0.068 7 μg/kg。

2.7 擴(kuò)展不確定度

置信概率約為95%，取包含因子k=2，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)生乳中L-羥脯氨酸的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：urel=k×urel(X)=2×0.068 7=0.137 4 μg/kg。

3 測(cè)量結(jié)果及其不確定度的報(bào)告

用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生乳中L-羥脯氨酸含量，測(cè)定結(jié)果可表示為：X=(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2。

4 結(jié)論

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)生乳中L-羥脯氨酸過(guò)程中的不確定度，主要來(lái)源于前處理的過(guò)程、天平的稱量過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程及濃度、回收率、重復(fù)性5個(gè)分量。對(duì)這5個(gè)分量進(jìn)行不確定度評(píng)定，最終得出擴(kuò)展不確定度為0.137 4 μg/kg，當(dāng)包含因子k=2、生乳中L-羥脯氨酸檢測(cè)值為375.123 5 μg/kg時(shí)，測(cè)定結(jié)果可表示為：(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2(置信概率約為95%)。

檢測(cè)結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于最小二乘法擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性及回收率，因此，可以采取增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的進(jìn)樣次數(shù)、增加平行樣品的測(cè)試，選擇精度更高的器皿來(lái)代替普通的器皿，優(yōu)化前處理過(guò)程等措施來(lái)減少各不確定度分量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，增加檢測(cè)結(jié)果的可信度。