金雀異黃酮對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠焦慮恐懼樣行為的干預(yù)作用*

陳瑞麒，曹方正，林慧敏，朱晨儀，鄒宛蕓，于子雯，周 歡，孟澤宇，范 勇，邱新宇，吳仲敏

（臺州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 臺州 318000）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是由于個體在生命的某個時刻遭受到突發(fā)的威脅事件或意外的嚴(yán)重創(chuàng)傷而引發(fā)的長期持續(xù)精神障礙［1］?；颊叱１憩F(xiàn)出嚴(yán)重的焦慮、恐懼以及對創(chuàng)傷相關(guān)環(huán)境的逃避，癥狀遷延時久甚至終身難愈，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。然而，至今在臨床上仍缺乏有效的防治藥物。金雀異黃酮（Genistein，GEN）是一種來源于大豆的天然異黃酮，具有抗氧化、免疫和抗炎活性，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能［2］，但其是否有防治PTSD作用，鮮有文獻(xiàn)報道。本研究采用連續(xù)單一應(yīng)激（SPS）和足底電擊（S）相結(jié)合方法制備 PTSD 大鼠模型［3］，并利用曠場實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）、高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實(shí)驗(yàn)和僵立行為實(shí)驗(yàn)來評價GEN對PTSD大鼠焦慮恐懼樣行為的干預(yù)作用，以期為PTSD的預(yù)防和治療提供新的用藥選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、藥物及試劑

EPM實(shí)驗(yàn)儀器（型號：JLBehv-OFT-4，上海吉量軟件科技有限公司）；OFT實(shí)驗(yàn)儀器（型號：JLBehv-EPMG，上海吉量軟件科技有限公司）；Super Maze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；GEN（貨號：FS-（BR）-0317，純度＞98%，上海撫生實(shí)業(yè)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性SD大鼠，SPF級，體重200±20 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大鼠經(jīng)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)，通過曠場箱開場實(shí)驗(yàn)，棄去水平運(yùn)動加上垂直活動總分低于10分者。將曠場箱開場實(shí)驗(yàn)合格的大鼠54只隨機(jī)分成三組，即：對照組、模型組、GEN干預(yù)組，每組18只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PTSD模型制備及干預(yù)方法

所有大鼠經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除外對照組，余下的36只大鼠均采用SPS+S方法制備PTSD模型，大鼠首先給予SPS刺激，即：禁錮2 h、強(qiáng)迫游泳20 min、乙醚麻醉至昏迷，30 min后將蘇醒的大鼠放置在電擊箱內(nèi)（電擊箱采用特制塑料制作，大小為40 cm×30 cm×25 cm），適應(yīng)196 s后給予足底電擊，電擊連續(xù)15個循環(huán)周期（電流0.8 mA，持續(xù)10 s，間歇10 s）。對照組大鼠放入同樣的電擊箱內(nèi)，停留10 min，但不給以足底電擊刺激。足底電擊刺激完成后所有大鼠均放回原鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境要求為：室溫22℃-25℃、晝夜節(jié)律、自由飲水?dāng)z食。每天上午9∶00予GEN干預(yù)組大鼠腹腔注射GEN 8 mg·kg-1，GEN首先在二甲基亞砜（DMSO）中以0.1 kg/L的濃度溶解，然后用生理鹽水稀釋至使用濃度。對照組和PTSD模型組大鼠則每日上午給予腹腔注射等濃度的二甲基亞砜生理鹽水。各組腹腔注射體積均為5 ml·kg-1，分別在連續(xù)給藥的第1，7，14天時隨機(jī)抽取各組大鼠6只進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.3.2 EPM實(shí)驗(yàn)

在連續(xù)給藥的第1，7，14天時分別隨機(jī)抽取各組大鼠6只進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)安排在安靜的曠場室內(nèi)進(jìn)行，所采用的曠場箱大小為100 cm×100 cm×40 cm，箱體呈立方形，內(nèi)側(cè)壁及底面涂以灰色，用黑線將底面劃分成25個小正方格，每個正方格的大小均為20 cm×20 cm。沿周邊的16個正方格為外周格，位于中央的9個正方格稱中央格。在正中央方格上方安置高像素攝像頭。曠場實(shí)驗(yàn)開始時將大鼠放入箱內(nèi)正中央方格中，采用Super Maze動物行為學(xué)視頻分析進(jìn)行攝像記錄，連續(xù)觀察5 min內(nèi)大鼠在曠場箱內(nèi)的運(yùn)動總路程、在中央格區(qū)域停留時間和在中央格區(qū)域活動次數(shù)。每只大鼠測試1次，每次測試后，立即使用75%酒精清潔箱內(nèi)壁及底面，再接著做下一只測試。

1.3.3 OFT實(shí)驗(yàn)

EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠分別進(jìn)行OFT實(shí)驗(yàn)，將待測試的大鼠放置在高架十字迷宮開臂與閉臂交匯處的正中央?yún)^(qū)域，大鼠頭部朝向開臂方向，采用Super Maze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)和滯留開臂時間。觀察各組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和滯留開臂時間百分比。

1.3.4 僵立行為實(shí)驗(yàn)

OFT實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)大鼠放回原造模電擊箱內(nèi)，觀察4 min內(nèi)大鼠出現(xiàn)僵立行為總次數(shù)，每10 s記錄一次，表現(xiàn)出僵立行為時記作陽性，以木僵率表示大鼠僵立陽性總次數(shù)占總次數(shù)的百分比。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)中需要記錄的評價指標(biāo)

1.3.5.1 OFT實(shí)驗(yàn)測試中，當(dāng)大鼠出現(xiàn)焦慮心理時，大鼠在開闊和新異環(huán)境中會表現(xiàn)出恐懼和探究之間的矛盾心理，在OFT實(shí)驗(yàn)時，焦慮越嚴(yán)重的大鼠越傾向于在外周格內(nèi)活動，以求得安全感。反之，焦慮情緒越低的大鼠，其進(jìn)入中央格的次數(shù)會越多，在中央格區(qū)域活動的時間也越長。實(shí)驗(yàn)評價指標(biāo)有：運(yùn)動總路程、停留中心格區(qū)域時間和進(jìn)入中心格區(qū)域次數(shù)。

1.3.5.2 EMP實(shí)驗(yàn)主要檢測大鼠對新異環(huán)境的探究能力以及對高懸開臂環(huán)境的恐懼情緒。焦慮程度越低的大鼠進(jìn)入開臂時間和次數(shù)就越多，反之則說明其焦慮程度越高。評價指標(biāo)包括：開臂時間百分比（%）、開臂次數(shù)百分比（%）。

1.3.5.3 僵立行為是大鼠表達(dá)恐懼情緒的外在行為方式，是一種典型的動物自我防御反應(yīng)，出現(xiàn)僵立行為的大鼠通常表現(xiàn)為刻板式蹲伏姿勢，外觀僅見有節(jié)律的呼吸運(yùn)動，其余的運(yùn)動均消失。通過計算木僵率來評價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用r檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GEN干預(yù)后PTSD大鼠OFT得分增加

見表1，圖1-3所示，在OFT測試中，實(shí)驗(yàn)第1天各組大鼠各項觀察指標(biāo)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)第7、14天時，PTSD模型組大鼠在運(yùn)動總路程、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域時間和次數(shù)均明顯減少，GEN干預(yù)組大鼠在運(yùn)動總路程、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域時間和次數(shù)均有明顯增加。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GEN干預(yù)7天組和14天組與同時間段對照組和PTSD組相比大鼠在運(yùn)動總路程（F=30.878，P=0.001；F=137.322，P=0.000），進(jìn)入中心區(qū)域時間（F=32.495，P=0.001；F=137.322，P=0.000）和進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)（F=20.600，P=0.002；F=41.198，P=0.000）上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步作二二比較發(fā)現(xiàn)GEN干預(yù)組與PTSD模型組之間上述指標(biāo)的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（所有P值均＜0.01），而GEN干預(yù)組與對照組之間上述指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果說明SPS+S應(yīng)激刺激有效引發(fā)了大鼠的焦慮恐懼樣行為，而GEN干預(yù)可以有效改善大鼠應(yīng)激所致的焦慮恐懼狀態(tài)。

表1 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=6，x±s）

圖1 大鼠曠場箱內(nèi)運(yùn)動總路程比較（n=6，x±s）

圖2 大鼠曠場箱內(nèi)進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)比較（n=6，x±s）

圖3 大鼠曠場箱內(nèi)中央?yún)^(qū)域停留時間比較（n=6，x±s）

2.2GEN干預(yù)后PTSD大鼠EMP得分增加

如表2，圖4-5。實(shí)驗(yàn)第1天各組大鼠在EMP中進(jìn)入開臂次數(shù)和在開臂區(qū)活動時間百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），GEN干預(yù)7天組和14天組與同時間段對照組和PTSD組比較大鼠在進(jìn)入開臂次數(shù)（F=38.140，P=0.000；F=56.980，P=0.000）和開臂滯留時間百分比（F=116.704，P=0.000；F=139.764，P=0.000）上差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，GEN干預(yù)組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)和開臂滯留時間百分比顯著高于PTSD模型組（P＜0.01），PTSD模型組大鼠在EPM中進(jìn)入開臂次數(shù)和開臂滯留時間百分比均顯著低于對照組（P＜0.01），而GEN干預(yù)組與對照組比較上述指標(biāo)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 大鼠高架十字迷宮測試結(jié)果比較（n=6，x±s）

圖4 大鼠高架十字迷宮內(nèi)進(jìn)入開臂次數(shù)比較（n=6，x±s，%）

圖5 大鼠高架十字迷宮內(nèi)開臂滯留時間比較（n=6，x±s，%）

2.3 GEN干預(yù)后PTSD大鼠木僵率降低

見表3，圖6所示。實(shí)驗(yàn)第1天各組大鼠木僵率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），GEN干預(yù)7天組和14天組與同時間段對照組和PTSD組比較大鼠木僵率（F=18.283，P=0.003；F=61.212，P=0.000）差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)二二比較發(fā)現(xiàn)GEN干預(yù)組大鼠木僵率顯著低于PTSD模型組（P＜0.01），PTSD模型組大鼠木僵率顯著高于對照組（P＜0.01），而GEN干預(yù)組大鼠木僵率略高于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 大鼠曠場箱內(nèi)僵立行為測定結(jié)果比較（n=6，x±s，%）

圖6 大鼠曠場箱內(nèi)僵立行為測定結(jié)果比較（n=6，x±s，%）

3 討論

PTSD是一種慢性精神疾病，患者常表現(xiàn)出嚴(yán)重的焦慮、恐懼以及對創(chuàng)傷相關(guān)環(huán)境的逃避。由于其發(fā)病的詳盡機(jī)制至今不清，長期以來缺乏有效的防治藥物。近年來，一些植物提取物在抗焦慮恐懼方面的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，有研究報道，銀杏內(nèi)酯B對高原缺氧大鼠焦慮樣行為有明顯減緩作用［4］。本研究采用SPS+S方法制備PTSD大鼠模型，并選用金雀異黃酮，一種天然植物中提取的異黃酮單體成分進(jìn)行干預(yù)治療，評價其對PTSD大鼠焦慮恐懼樣行為的干預(yù)效果。

本研究采用OFT、EPM和僵立行為等經(jīng)典的動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來評價PTSD大鼠在焦慮恐懼樣行為方面的變化以及GEN的干預(yù)作用。OFT實(shí)驗(yàn)中大鼠在曠場箱內(nèi)運(yùn)動總路程反應(yīng)了大鼠的興奮性和靈活性，我們發(fā)現(xiàn)GEN干預(yù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)的第7、14天時運(yùn)動總路程明顯高于PTSD模型組，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1，圖1），表明GEN可以改善SPS+S所致的大鼠興奮性下降。同時，GEN干預(yù)組大鼠在進(jìn)入中心區(qū)域的時間和次數(shù)上均顯著多于PTSD模型組（P＜0.01），說明GEN干預(yù)可以有效改善大鼠的焦慮恐懼狀態(tài)。在EPM實(shí)驗(yàn)中，PTSD模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)的第7、14天時進(jìn)入開臂的時間和次數(shù)顯著低于正常對照組（P＜0.01），而GEN干預(yù)組上述指標(biāo)值明顯高于PTSD模型組（P＜0.01），說明GEN干預(yù)下大鼠的焦慮恐懼情緒有了一定程度的緩解。進(jìn)一步的僵立行為測試發(fā)現(xiàn)，GEN組大鼠的木僵率較之模型組有顯著降低（P＜0.01），表明GEN可以有效減緩PTSD大鼠的恐懼表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)第1天時各組大鼠各項行為學(xué)指標(biāo)值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而在實(shí)驗(yàn)第7、14天時上述指標(biāo)值差異均有顯著意義，表明SPS+S刺激、GEN干預(yù)與大鼠行為學(xué)改變之間均存在一定的時效關(guān)系，通過上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步說明長時程的GEN干預(yù)對SPS+S導(dǎo)致的大鼠焦慮恐懼樣行為有明顯的改善作用。

GEN與雌激素具有相似的結(jié)構(gòu)，是典型的植物雌激素［5］，在臨床上作為激素治療的一種替代方法，有效地緩解絕經(jīng)后婦女的抑郁癥狀［6］，此外，在去卵巢雌性大鼠中也觀察到GEN的抗抑郁作用［7］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GEN干預(yù)后PTSD大鼠在OFT新異環(huán)境中的過度焦慮以及高架十字迷宮空曠條件下的條件性恐懼行為均有不同程度的減緩，大鼠的運(yùn)動距離和探索時間也有明顯增加（表1、2）。這些結(jié)果表明，GEN在緩解PTSD大鼠的焦慮恐懼行為方面是有效的。本實(shí)驗(yàn)的研究對象為成年雄性大鼠，因此很難以雌激素替代品來解釋GEN的抗焦慮恐懼機(jī)制。有研究報道，PTSD大鼠杏仁核腦區(qū)5-羥色胺含量明顯降低，而GEN通過上調(diào)應(yīng)激大鼠杏仁核神經(jīng)元色氨酸羥化酶活性，增加5-羥色胺的生物合成，并通過不同的5-羥色胺受體和相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)情緒相關(guān)行為［8，9］。也有報道認(rèn)為GEN的潛在作用靶點(diǎn)包括 GABA［10］、甘氨酸［11］，5-羥色胺［12］，Ca2+通道［13］等。我們認(rèn)為，GEN 可能還參與調(diào)控除杏仁核外的其他腦區(qū)如海馬、前額皮質(zhì)、丘腦、下丘腦和扣帶回等的神經(jīng)遞質(zhì)水平和對應(yīng)受體的活性，并通過相關(guān)的信號通路來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的情緒調(diào)節(jié)功能。本研究發(fā)現(xiàn)了GEN對PTSD大鼠焦慮恐懼樣行為的明顯調(diào)節(jié)作用，但其確切的作用機(jī)制尚不清楚，值得深入研究。