白芍提取物對(duì)羅非魚氧化損傷的保護(hù)作用

李 堯，賈 睿，杜金梁，曹麗萍，顧?quán)嶇?，錢 皓，鄭 濤，Galina Jeney，徐 跑,，殷國俊,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，魚類免疫藥理國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081；4.National Agricultural Research Center,Research Institute for Fisheries and Aquaculture,Anna Light 8,Szarvas 5440,Hungary)

集約化養(yǎng)殖條件下，魚類不可避免地受到多種應(yīng)激因子的刺激，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，過多的ROS可攻擊生物膜、蛋白質(zhì)和DNA，造成機(jī)體組織損傷，進(jìn)而影響魚類正常的生理和行為活動(dòng)[2]。過氧化氫(H2O2)為典型的ROS之一，可直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，引起氧化損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 因此常用于構(gòu)建氧化應(yīng)激或氧化損傷模型[3]。在哺乳動(dòng)物中，由H2O2損傷的肝臟和肝細(xì)胞模型通常用于篩選肝臟保護(hù)劑[4]。在魚類中也已報(bào)道H2O2可誘導(dǎo)草魚卵巢細(xì)胞損傷[5]。

中草藥在我國歷史悠久，被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖和疾病防治中[6-7]。中草藥制劑在草魚、團(tuán)頭魴等的炎癥防治、免疫力增強(qiáng)方面具有顯著作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)一些中草藥對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的魚類肝損傷具有治療作用[9]。白芍提取物(PARE，paeoniae alba radix extract)是從植物芍藥根中提取的天然化合物,其主要活性成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酞等[10]，具有抑制活性氧自由基形成、清除多余自由基、減輕氧化損傷誘導(dǎo)的肝損傷等作用[11-12]。在水產(chǎn)動(dòng)物中，陳錫強(qiáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚節(jié)間血管生長，提高免疫能力和具有抗腫瘤作用；王慶奎等[14]發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠增強(qiáng)斑點(diǎn)叉尾鮰血液白細(xì)胞吞噬能力，對(duì)血液生化指標(biāo)具有積極作用。但是關(guān)于白芍提取物對(duì)魚類肝損傷保護(hù)和抗氧化性能方面的研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在飼料中添加白芍提取物，通過檢測肝、鰓、肌肉和血清中生化指標(biāo)的變化來評(píng)估其對(duì)羅非魚(Oreochromisniloticus)抗氧化能力的影響；并用H2O2誘導(dǎo)羅非魚肝損傷，測定其血清和肝組織中生化指標(biāo)和基因表達(dá)的變化，評(píng)估白芍提取物對(duì)肝損傷和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，為魚類保肝藥物的開發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)羅非魚由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心養(yǎng)殖基地提供。實(shí)驗(yàn)正式開始前，實(shí)驗(yàn)魚被暫養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水溫(30±2)℃，pH 6.8～7.6，溶解氧> 6 mg/L，每天10%的水交換量)；并以2%體重的基礎(chǔ)飼料飼喂，一天兩次(8∶30、15∶30)?；A(chǔ)飼料配方見表1[15]。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平

注：每公斤飼料含維生素：VA 10 mg，VB150 mg，VB2200 mg，VB3500 mg，VB650 mg，VB75 mg，VB11 15 mg，VB120.1 mg，VC 1 000 mg，VD 0.05 mg，VE 400 mg，VK 40 mg,肌醇2 000 mg，膽堿5 000 mg。

每公斤飼料含礦物質(zhì)：FeSO4·7H2O 372 mg，CuSO4·5H2O 25 mg，ZnSO4·7H2O 120 mg，MnSO4·H2O 5 mg，MgSO42 475 mg，NaCl 1 875 mg，KH2PO41 000 mg，Ca(H2PO4)22 500 mg。

1.2 藥品、試劑及儀器

白芍提取物(白芍苷10%)購于西安匯林生物科技有限公司(陜西西安)；實(shí)驗(yàn)所用的麻醉劑和H2O2試劑購自南京凱基生物技術(shù)有限公司(江蘇南京)，磷酸鹽緩沖液從Sigma Company(St.Louis，MO，USA)訂購；總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)等試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖

將健康的羅非魚隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組(不添加藥物，不注射H2O2)、H2O2組(不添加藥物，注射H2O2)和白芍提取物組(0.5、1、5 g/kg，注射H2O2)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每缸15尾魚?？瞻讓?duì)照組和H2O2組投喂基礎(chǔ)日糧，白芍提取物組分別投喂含0.5、1、5 g/kg白芍提取物的日糧。飼養(yǎng)60 d后，對(duì)所有魚進(jìn)行稱重，并從空白對(duì)照組和白芍提取物組(0.5、1、5 g/kg)分別隨機(jī)選取15條羅非魚置于0.05% MS-222水溶液中(三甲基甲磺酸鹽，Sigma，MO，USA)麻醉，采集血液、肝、鰓和肌肉組織檢測SOD、 GSH、T-AOC和MDA，評(píng)估白芍提取物對(duì)羅非魚抗氧化能力的影響。

氧化損傷實(shí)驗(yàn)：投喂60 d后，每組隨機(jī)挑選15條羅非魚進(jìn)行氧化損傷實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組腹腔注射生理鹽水，H2O2組和白芍提取物組腹腔注射300 mmol/L H2O2。24 h后，將實(shí)驗(yàn)魚置于0.05% MS-222水溶液中麻醉，并立即采集血液和肝組織，檢測血清GPT、 GOT、 TP和Alb等生化指標(biāo)，肝勻漿SOD、GSH、T-AOC和MDA等生化指標(biāo)和TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表達(dá)，評(píng)估白芍提取物對(duì)羅非魚肝損傷和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

1.4 生化指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書，用相應(yīng)的試劑盒分別測定血清生化指標(biāo)GPT、GOT、TP、Alb、SOD、GSH、T-AOC和MDA；肝、鰓和肌肉組織勻漿生化指標(biāo)SOD、GSH、T-AOC和MDA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

取適量的肝組織加入RNAiso Plus(Takara，大連)提取總RNA。通過Gene Quant1300紫外可見分光光度計(jì)(GE Healthcare Biosciences公司)測定RNA的濃度和純度，然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)合成cDNA。

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10的基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑盒說明書。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃ 、10 s；40個(gè)循環(huán) 95 ℃、5 s，60 ℃、 1 min。內(nèi)參引物和特異性引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列見表2，β-actin基因作為內(nèi)參基因，用2-△△Ct方法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物

1.6 計(jì)算公式

特定生長率(SGR)= [ lnWt-lnW0]/t×100%;

飼料系數(shù)(FCR)= FI/(Wt-W0)

式中，W0為魚初體均重(g)；Wt為魚末體均重(g)；t為飼喂天數(shù)(d)；FI為每尾魚平均攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)(g)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有數(shù)據(jù)通過單因素方差進(jìn)行(ANOVA)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對(duì)不同組間數(shù)據(jù)進(jìn)行 Tukey 多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 白芍提取物對(duì)羅非魚生長的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，羅非魚投喂含白芍提取物的飼料60 d后，特定生長率略高于對(duì)照組，餌料系數(shù)略低于對(duì)照組，但均無顯著性差異。

表3 白芍提取物對(duì)羅非魚生長的影響

2.2 白芍提取物對(duì)羅非魚肝、鰓、肌肉和血清抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化的影響

表4所示，在肝組織中，與對(duì)照組相比， 1和5 g/kg白芍提取物顯著提高了SOD活力、促進(jìn)了GSH和T-AOC的形成、降低了MDA含量 。鰓組織中，SOD、GSH和 T-AOC水平在 5 g/kg白芍提取物組中被顯著提高，同時(shí)MDA形成被顯著抑制。肌肉組織中，三種不同濃度白芍提取物對(duì)抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化水平?jīng)]有顯著影響。血清中，與對(duì)照組相比，5 g/kg白芍提取物顯著提高了SOD酶活性和T-AOC水平，同時(shí)1 g/kg 白芍提取物也提高了T-AOC水平。

表4 注射H2O2前白芍提取物對(duì)羅非魚肝、鰓、肌肉和血清SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影響

注：同一行數(shù)值右上角標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 白芍提取物對(duì)H2O2損傷后羅非魚血清GPT和GOT活性的影響

如圖1所示， H2O2損傷后GPT和GOT活性極顯著升高，而三種不同濃度白芍提取物的飼料預(yù)處理后，GPT和GOT活力均極顯著下降。

圖1 白芍提取物對(duì)H2O2處理后羅非魚血清GPT和GOT活性的影響Fig.1 Effects of PARE on serum GPT and GOT after H2O2 injection0.5 group示0.5 g/kg白芍提取物組；1 group示1 g/kg白芍提取物組；1.5 group示1.5 g/kg白芍提取物組不同字母表示組間具有差異顯著P<0.05，下同

2.4 白芍提取物對(duì)H2O2損傷后羅非魚血清TP和Alb含量的影響

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，H2O2組中TP和Alb含量顯著降低，而三種不同濃度白芍提取物的飼料預(yù)處理后，血清TP含量降低被顯著抑制；同樣，5 g/kg白芍提取物預(yù)處理后，血清Alb水平也呈現(xiàn)了類似的變化。

2.5 白芍提取物對(duì)H2O2損傷后羅非魚肝臟SOD、 GSH、T-AOC和 MDA的影響

通過測定肝組織勻漿中的SOD、GSH、T-AOC和MDA來評(píng)估白芍提取物的抗氧化能力和對(duì)羅非魚肝損傷的保護(hù)作用。如圖3所示， H2O2處理24 h后，SOD、 GSH和T-AOC水平顯著下降，而MDA含量顯著升高。與H2O2組相比，1 g/kg白芍提取物預(yù)處理后， SOD水平和GSH含量顯著升高；同時(shí)1和5 g/kg白芍提取物也顯著提高了T-AOC水平；與此相反，三種不同濃度的白芍提取物預(yù)處理顯著抑制了MDA形成。

2.6 白芍提取物對(duì)H2O2損傷后羅非魚肝TNF-α、 IL-1β、 IL-8 和IL-10基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，H2O2損傷引起了TNF-α、IL-1β和IL-8基因顯著上調(diào)，以及IL-10基因顯著下調(diào)。與H2O2組相比，三種不同濃度的白芍提取物顯著抑制了TNF-α、IL-1β和IL-8基因的上調(diào)，同時(shí)IL-10基因的下調(diào)在0.5和1 g/kg白芍提取物作用也被顯著抑制。

圖2 白芍提取物對(duì)H2O2處理后羅非魚血清TP和Alb的影響Fig.2 Effects of PARE on serum TP and Alb after H2O2 injection

圖3 白芍提取物對(duì)H2O2處理后羅非魚肝臟SOD、GSH、T-AOC和 MDA的影響Fig.3 Effects of PARE on liver SOD,GSH,T-AOC and MDA after H2O2 injection

圖4 白芍提取物對(duì)H2O2處理后羅非魚肝TNF-α、IL-1β、IL-8 和 IL-10基因表達(dá)的影響Fig.4 The changes of TNF-α,IL-1β,IL-8 and IL-10 mRNA levels in liver of tilapia treated with H2O2

3 討論

與哺乳動(dòng)物類似，魚類也具有抗氧化系統(tǒng)，主要由抗氧化酶(如SOD等)和非酶抗氧化物質(zhì)(如GSH等)，在抵御氧化應(yīng)激、清除多余自由基和維持機(jī)體氧化還原狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用。同時(shí)，抗氧化系統(tǒng)與機(jī)體免疫力密切相關(guān)，其各成分的活性或含量的變化與多種疾病相關(guān)。已有研究表明氧化應(yīng)激以及抗氧化能力的降低與肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)[16]。

H2O2為常見的氧化劑，廣泛用于誘導(dǎo)多種細(xì)胞和動(dòng)物建立氧化應(yīng)激模型[17-18]。在肝細(xì)胞中，H2O2處理可能導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，并伴隨著細(xì)胞質(zhì)酶GPT和GOT的滲漏[19-21]，因此， GPT和GOT為經(jīng)典的肝損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中，H2O2處理后，血清中GPT和GOT的酶活性顯著增加，表明氧化應(yīng)激引起嚴(yán)重的肝損傷。而白芍提取物處理組中GPT和GOT活性顯著降低，同時(shí)TP和Alb 含量的顯著降低，表明白芍提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)抑制肝組織中蛋白損傷。有研究者推測這種保護(hù)機(jī)制與其抗磷脂氧化作用有關(guān)[22]。在哺乳動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)白芍提取物能夠有效地抗脂質(zhì)氧化，抑制了GPT和GOT從肝細(xì)胞釋放到血液中，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和在小鼠的研究結(jié)果一致[11]。

研究發(fā)現(xiàn)多種藥物的抗氧化能力在肝保護(hù)中起著主要作用[22]。哺乳動(dòng)物中的研究表明，白芍提取物能夠顯著提高SOD活性和T-AOC的含量，緩解自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，白芍提取物可有效提高血清、肝和鰓中SOD、T-AOC和GSH水平，表明白芍提取物可提高羅非魚抗氧化能力。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，白芍提取物預(yù)處理可不同程度地抑制了SOD、GSH和T-AOC水平的下降，這表明白芍提取物能促進(jìn)羅非魚肝組織中抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)的形成，進(jìn)而清除多余的自由基，抑制氧化應(yīng)激引起的肝損傷。

脂質(zhì)過氧化是肝損傷的重要指標(biāo)之一，MDA是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，其水平的升高可以反映肝臟脂質(zhì)過氧化損傷程度[23]。秦亞東等研究結(jié)果顯示，白芍提取物可抑制MDA的上升，阻止脂質(zhì)過氧化引起的肝細(xì)胞損傷[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2可顯著增加羅非魚肝組織MDA的含量，促使肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，加劇羅非魚肝損傷；而不同水平的白芍提取物處理后MDA的生成顯著被抑制。表明白芍提取物可以抑制H2O2引起的羅非魚肝組織中脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，改善氧化應(yīng)激，保護(hù)羅非魚肝組織細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能不受過氧化物的損害。這與在小鼠和其他哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果一致[12]。

研究表明炎癥反應(yīng)為肝損傷發(fā)生的主要癥狀之一。TNF-α、IL-1β和IL-8是魚類炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在肝損傷中起著重要的作用[24]。H2O2誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)生時(shí)，肝臟Kupffer細(xì)胞會(huì)分泌促炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-8等[25]，同時(shí)啟動(dòng)炎癥信號(hào)通路加重炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)肝損傷和纖維化[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，H2O2損傷顯著促進(jìn)了TNF-α、IL-1β和IL-8基因表達(dá)的上調(diào)，表明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而用0.5、1和5 g/kg白芍提取物的飼料飼喂后，羅非魚肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-8基因水平均顯著降低，這表明白芍提取物具有抗炎作用，可顯著緩解羅非魚肝組織炎癥反應(yīng)，抑制肝損傷發(fā)生。

IL-10為炎癥反應(yīng)過程中最主要的負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有廣泛的抑制炎癥活性作用[23]。IL-10能夠抑制TNF-α產(chǎn)生，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖，在肝損傷中發(fā)揮著極其重要的保護(hù)作用[24]。在小鼠中的研究表明，內(nèi)源性IL-10通過減輕炎癥反應(yīng)而影響肝細(xì)胞壞死，修復(fù)肝損傷[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2可顯著降低羅非魚肝組織IL-10的基因表達(dá)量，促使肝細(xì)胞損傷；而白芍提取物(0.5和1 g/kg)處理后IL-10的基因表達(dá)量均顯著上升。表明白芍提取物可促進(jìn)IL-10表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而有效保護(hù)肝損傷，本研究結(jié)果與在小鼠和其他哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果一致[28]。以上結(jié)果也表明白芍提取物保肝作用與其抗炎性作用相關(guān)。