基于CO I和Cytb DNA條形碼在鲌屬魚類物種鑒定中的應(yīng)用

王利華，羅相忠，王 丹，李 偉，李 忠，鄒桂偉，梁宏偉,3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動物基因組學(xué)重點實驗室，武漢 430223)

鲌屬(Culter)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)，為東亞特有鯉科魚類，主要分布在中國、朝鮮、越南和俄羅斯等國[1]。在我國，除新疆和青藏高原外，廣泛分布在各大江河、湖泊和水庫中，已成為我國重要的經(jīng)濟魚類。鲌屬魚類共有9個種和亞種，由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，越來越受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視，養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增加。然而，由于過度捕撈、棲息地破壞以及水質(zhì)污染等因素的影響，天然鲌類資源數(shù)量銳減，野生鲌種群呈現(xiàn)出低齡化和小型化[2-3]。而鲌屬有些物種外部形態(tài)差異較小，準(zhǔn)確鑒定存在一定的困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)是2003年Hebert提出的利用線粒體DNA(mitochondrial DNA)特定片段進(jìn)行物種分類鑒定的技術(shù)，并希望能賦予所有生物各自的條形碼[4]，即生物體內(nèi)能夠代表該物種，有足夠變異且容易擴增的DNA片段[5]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種的鑒定[6-7]。在線粒體的13個編碼蛋白基因中，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit I，COⅠ)和細(xì)胞色素b(Cytochrome b，Cytb)基因是其中結(jié)構(gòu)和功能研究最為清楚，且長度適宜、相對保守、進(jìn)化速度適中，具有足夠多能夠區(qū)分近緣種的變異[8,9]，已被作為DNA條形碼廣泛用于水產(chǎn)物種的鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)和種群資源狀況分析[10]。

開展水產(chǎn)種質(zhì)資源鑒定、遺傳評價和挖掘利用研究的前提是對物種的準(zhǔn)確分類和鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定作為一種重要的傳統(tǒng)分類鑒定方法為物種的分類鑒定奠定了堅實的基礎(chǔ)，但該方法依賴于形態(tài)學(xué)特征和鑒定者的經(jīng)驗，而魚類的外部形態(tài)特征又往往受到棲息環(huán)境、發(fā)育階段以及性別異型的影響而存在一定的差異，增加了分類鑒定的難度，極易造成混淆，加之由于分類學(xué)觀點不同所形成的分類系統(tǒng)也往往差異較大，鑒定時有時會產(chǎn)生一些爭議或錯誤[11]。很多魚類的分類鑒定已經(jīng)無法靠單一的形態(tài)學(xué)鑒定來完成，DNA條形碼技術(shù)因不受物種發(fā)育階段和生長環(huán)境等因素的限制，且對于鑒定隱存種以及形態(tài)不易區(qū)分的物種具有明顯的優(yōu)勢，是對傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)方法的有力補充[12]。

為了獲得DNA條形碼在鲌屬魚類分類鑒定中的有效性，本研究通過分析達(dá)氏鲌、海南鲌、尖頭鲌、蒙古鲌、擬尖頭鲌和翹嘴鲌6種鲌屬魚類線粒體COⅠ和Cytb基因片段的序列特征、種內(nèi)和種間的遺傳距離以及分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，探究COⅠ和Cytb基因作為DNA條形碼在鲌屬魚類物種分類鑒定中的適用性，為鲌屬魚類的準(zhǔn)確鑒定、種質(zhì)資源的保護(hù)以及可持續(xù)挖掘利用等提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

依據(jù)《中國動物志 硬骨魚綱 鯉形目》對收集的魚類標(biāo)本進(jìn)行分類鑒定，共得到6種鲌屬魚類，樣品編號及采集地點等信息見表1。將標(biāo)本保存于無水乙醇中，存放在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所長江流域漁業(yè)生物標(biāo)本庫中。取肌肉組織樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，提取采用本實驗室改進(jìn)的高鹽法[13]，DNA經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計、PCR擴增及測序

線粒體COⅠ和Cytb基因分別采用通用引物COI-F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，COI-R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA和Cytb-F：GACTTGAAAAACCACCGTTG，Cytb-R：CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC進(jìn)行擴增[14]，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

PCR擴增反應(yīng)總體積為25 μL，包含10×PCR Buffer 2.5 μL，0.25 mmol/L dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶(Takara)1 μL，0.2 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 50 ng，最后由超純水補足體系。反應(yīng)在S1000型PCR儀上進(jìn)行，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，(COⅠ，52 ℃；Cytb，47 ℃)退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 研究所用樣本信息

PCR擴增產(chǎn)物用DNA片段凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行膠回收純化后，使用Solution I(Takara)將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體(Takara)連接克隆，挑選陽性菌落，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

獲得的6種魚類基因序列通過DNAStar軟件對其進(jìn)行比對和人工校正后，與GenBank中已提交序列比對驗證，并從GenBank得到5種鲌屬魚類線粒體全基因組11個(序列信息見表1)，獲取COⅠ和Cytb相應(yīng)擴增區(qū)域。利用DnaSP 5.10軟件計算序列的保守位點(C)、變異位點(V)、簡約信息位點(Pi)及自裔位點(S)等參數(shù)；MEGA 7.0計算堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉(zhuǎn)換、顛換頻率和轉(zhuǎn)換顛換比等。利用DAMBE 5.02進(jìn)行序列替代飽和度分析，并利用MEGA 7.0通過K2P(Kimura 2-parameter)雙參數(shù)替代模型計算種內(nèi)距離和種間距離，并以此模型構(gòu)建鲌屬六種魚類基于COⅠ和Cytb基因片段的鄰接(Neighbor-Joining，NJ)樹，以三角魴(Megalobramaterminalis，GP7)和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala，GP8 )為外群，采用1 000次自展分析檢驗(bootstrap)各個節(jié)點的置信度[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

2.1.1COⅠ的堿基組成特點分析

獲得6種鲌屬魚類50條COⅠ基因序列長度為645 bp，其中，保守位點582個，變異位點63個，簡約信息位點56個和自裔位點7個，沒有發(fā)現(xiàn)任何堿基的插入和缺失(表2)，共發(fā)生轉(zhuǎn)換17次，顛換2次，轉(zhuǎn)換位點與顛換位點比率R為6.68。COⅠ基因序列的A、T、G和C堿基平均含量分別為25.65%、28.18%、18.33%和27.84%，(A+T)含量53.83%明顯高于(G+C)的含量46.17%，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性，堿基組成在6種鲌屬魚間無顯著差異，與其他硬骨魚類線粒體COⅠ基因堿基組成的基本特征一致[15]；COⅠ第一密碼子的GC平均含量為58.57%，第二和第三密碼子的平均含量分別為43.33%和37.18%。堿基變異主要發(fā)生在第三位密碼子，堿基變異較大，進(jìn)化速度最快，第二密碼子位點最穩(wěn)定，無轉(zhuǎn)換與顛換發(fā)生。

表2 6種鲌屬魚類COⅠ基因序列堿基組成

注：ii=不變位點數(shù)；si=轉(zhuǎn)換數(shù)；sv=顛換數(shù)；R=si/sv，表3同。

2.1.2Cytb的堿基組成特點分析

50個個體Cytb基因片段長度為970 bp的，包含保守位點824個，變異位點146個，簡約信息位點139個，自裔位點7個，轉(zhuǎn)換與顛換比率R為9.53.Cytb基因序列的平均堿基組成為27.97% A、27.93% T、14.53% G、29.57% C(表3)，AT含量為55.90%，明顯高于GC含量(44.10%)，堿基G含量約為C含量的1/2，明顯低于其他3種堿基含量，與已報道魚類線粒體Cytb基因序列特征一致[16]，不同鲌屬魚的Cytb序列堿基組成無明顯差異；Cytb第一密碼子的GC平均含量為43.99%，第二密碼子為46.17%，第三密碼子為41.56%；轉(zhuǎn)換位點和顛換位點總數(shù)分別為45個和5個，堿基變異均勻的分布于該序列的各個區(qū)域，但有明顯的密碼子偏好，第一密碼子的轉(zhuǎn)換和顛換位點最多，分別為29個和3個，堿基轉(zhuǎn)換與顛換的比值為8.20，轉(zhuǎn)換明顯多于顛換。

表3 6種鲌屬魚類Cytb基因序列堿基組成

2.2 COⅠ與Cytb遺傳距離分析

生物條形碼協(xié)會(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)推薦K2P雙參數(shù)模型作為計算遺傳距離的方法[17]?；?0個個體COⅠ和Cytb基因序列，采用K2P雙參數(shù)模型統(tǒng)計的六種鲌屬魚類的種內(nèi)、種間的遺傳距離見表4和表5。基于COⅠ基因序列的種內(nèi)遺傳距離為0%～0.3%，平均遺傳距離為0.17%，種間遺傳距離為0.3%～5.0%，平均遺傳距離為3.54%，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的20.82倍；基于Cytb基因序列的種內(nèi)遺傳距離為0%～0.4%，平均遺傳距離為0.18%，種間遺傳距離為0.1%～7.4%，平均遺傳距離為5.92%，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的32.89倍；基于COⅠ和Cytb基因序列的六種鲌屬魚類種內(nèi)遺傳距離均小于2%的標(biāo)準(zhǔn)[18]，大部分魚類的種間與種內(nèi)遺傳距離的比值均符合“10×規(guī)則”[19]，COⅠ與Cytb均能作為條形碼較好地區(qū)分6種鲌。但是，也有一些魚類種間的遺傳距離小于10倍的種內(nèi)遺傳距離?；贑OⅠ基因序列的翹嘴鲌和海南鲌、尖頭鲌和擬尖頭鲌之間的種間距離/種內(nèi)遺傳距離小于10×的標(biāo)準(zhǔn)，然而，基于Cytb基因序列的翹嘴鲌與海南鲌種間距離/種內(nèi)距離符合10×標(biāo)準(zhǔn)，但尖頭鲌與擬尖頭鲌的種間距離/種內(nèi)距離仍然小于10×標(biāo)準(zhǔn)。

表4 鲌屬六種魚類基于COⅠ基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離

表5 鲌屬六種魚類基于Cytb基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離

2.3 飽和度分析

COⅠ和Cytb基因的序列替代飽和度分別運用DAMBE 5.02軟件進(jìn)行測試，得出的結(jié)果如表6、表7所示，Iss

表6 COⅠ基因飽和度分析結(jié)果

表7 Cytb基因飽和度分析結(jié)果

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用鄰接法構(gòu)建鲌屬六種魚類的NJ樹，以三角魴(Megalobramaterminalis，GP7)和團(tuán)頭魴(M.amblycephala，GP8 )作為外群，進(jìn)行1 000次自展分支檢驗構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹(NJ)，構(gòu)建的基于COⅠ和Cytb基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1和圖2，基于COⅠ與Cytb基因序列的分子進(jìn)化樹結(jié)果基本一致，基本上同一物種的個體首先聚在一起，再與同一屬的其他物種序列聚在一起，翹嘴鲌全部個體聚在一起形成一個單系(節(jié)點支持率為100%、99%)，達(dá)氏鲌(節(jié)點支持率為98%、100%)和蒙古鲌(節(jié)點支持率為99%、100%)的全部個體也分別形成單系，海南鲌6個體形成一個單系(節(jié)點支持率為100%、100%)，這4種鲌均能得到有效區(qū)分。而擬尖頭鲌在基于COⅠ構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中未能首先聚在一起，但基于Cytb的系統(tǒng)進(jìn)化樹中能夠得到有效區(qū)分。

圖1 基于COⅠ基因的六種鲌屬魚類NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 NJ tree based on COⅠsequences of 6 Culter species注：C.dabryi 1-10，本研究序列；C.dabryi 11-15，GenBank獲取序列；C.recurviceps 1-5，本研究序列；C.recurviceps 6，GenBank獲取序列；C.mongolicus 1-10，本研究序列；C.mongolicus 11，GenBank獲取序列；C.oxycephaloides 1-3，本研究序列，C.oxycephaloides 4-5，GenBank獲取序列；C.alburnus1-10，本研究序列；C.alburnus11-12，GenBank獲取序列.

圖2 鲌屬六種魚類基于Cytb基因的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ tree based on Cytb sequences of 6 Culter species注：C.dabryi 1-10，本研究序列；C.dabryi 11-15，GenBank獲取序列；C.recurviceps 1-5，本研究序列；C.recurviceps6，GenBank獲取序列；C.mongolicus 1-10，本研究序列；C.mongolicus 11，GenBank獲取序列；C.oxycephaloides 1-3，本研究序列，C.oxycephaloides 4-5，GenBank獲取序列；C.alburnus1-10，本研究序列；C.alburnus11-12，GenBank獲取序列.

3 討論

3.1 COⅠ與Cytb基因序列

鲌屬六種魚類的COⅠ與Cytb基因AT含量都明顯高于GC的含量，與在硬骨魚類上的堿基組成一致[14,16]。COⅠ第一密碼子的GC平均含量最高，第三密碼子含量最低，與彭居俐等[19]報道的鯉科鲌屬魚類結(jié)果相符，也與柳淑芳等[20]報道的石首魚科的結(jié)果一致；Cytb第一密碼子的平均GC含量為43.99%，第二密碼子含量最高(46.17%)，第三密碼子的GC含量最低，這與劉璐等[7]報道的鯔科魚類的結(jié)果一致，COⅠ和Cytb基因序列的GC含量(46.17%、44.10%)均低于AT(53.83%、55.90%)含量，表明了鲌屬魚類線粒體基因組在進(jìn)化上存在很強的GC→AT的選擇壓力，符合線粒體基因組的堿基組成特點[7]。在DNA的進(jìn)化過程中，通常轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率比顛換高的多，進(jìn)化速率由轉(zhuǎn)換與顛換的比值R來衡量[21]。COⅠ和Cytb基因序列的轉(zhuǎn)換顛換比R分別為6.68和9.53，遠(yuǎn)大于2，表明基因序列替換遠(yuǎn)未達(dá)到飽和[11,19]。

3.2 物種鑒定

Ward研究了隸屬于11個門的13 320個物種的COⅠ序列，認(rèn)為2%的遺傳距離可以有效區(qū)分為不同物種，大多數(shù)種內(nèi)序列之間的差異均低于1%[15]。Avise等[22]也確定了2%的Cytb序列差異用于區(qū)分脊椎動物的不同物種，本研究中，COⅠ和Cytb鲌屬六個種群內(nèi)差異均遠(yuǎn)小于臨界值，與謝佳燕等[23]在鯉科鲌屬魚類線粒體COⅠ基因DNA條形碼種內(nèi)遺傳距離均小于1%的研究結(jié)果相一致。但是，基于COⅠ基因序列的翹嘴鲌和海南鲌種間/種內(nèi)遺傳距離小于10，而基于Cytb基因序列的種間/種內(nèi)遺傳距離符合10×規(guī)則，可能由于COⅠ基因序列片段較短，包含的信息還比較有限，將COⅠ與Cytb基因結(jié)合起來用于DNA條形碼來進(jìn)行鲌屬魚類的分類鑒定更加可靠；然而，無論基于COⅠ還是Cytb基因序列，尖頭鲌和擬尖頭鲌種間/種內(nèi)遺傳距離均小于10，究其原因可能是：尖頭鲌和擬尖頭鲌數(shù)量偏少，本研究中只收集到尖頭鲌1尾個體，擬尖頭鲌也僅有5條，且GenBank中沒有尖頭鲌的基因序列信息，兩個物種親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征存在很多相似之處，尖頭鲌與擬尖頭鲌的外部形態(tài)差別較小，僅依據(jù)COⅠ和Cytb序列提供的變異信息不足以將物種有效分開，因此，僅使用COⅠ和Cytb作為DNA條形碼仍顯不足，還需要收集更多的憑證標(biāo)本，聯(lián)合更多的線粒體DNA分子標(biāo)記或核基因分子標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

3.3 基于COⅠ與Cytb鲌屬魚類的系統(tǒng)進(jìn)化分析

線粒體DNA具有進(jìn)化速率快，呈母系遺傳等特點，相對于AFLP、ISSR和RAPD等序列分析方法而言，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建方面更加準(zhǔn)確和可靠[24,25]。本研究利用獲得的COⅠ和Cytb基因片段進(jìn)行鲌屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌均先與海南鲌聚在一起形成一個姐妹群，然后再與達(dá)氏鲌相聚，形成一個單系群，親緣關(guān)系較近，這與馮曉宇等報道的鲌屬研究結(jié)果基本一致[26]；尖頭鲌和擬尖頭鲌聚合后再與蒙古鲌聚為一支，也形成一個單系群，具有較近的親緣關(guān)系，節(jié)點支持率均較高?；趦蓚€基因序列得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹高度相似，說明本研究得到的鲌屬六種魚的系統(tǒng)關(guān)系具有較高的可靠性。但與Zhang等[27]在鲌屬形態(tài)學(xué)分類中翹嘴鲌和海南鲌聚在一起后與達(dá)氏鲌和尖頭鲌聚合的姐妹群形成一個單系，然后與擬尖頭鲌聚在一起，最后與蒙古鲌聚合的結(jié)果不完全相符，這可能是由于分子系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)特征存在不一致的現(xiàn)象造成的，也可能是由于本研究中樣本數(shù)偏少，序列包含的信息不足導(dǎo)致的。因此，下一步將更大范圍內(nèi)采集鲌屬魚類，收集更多的憑證標(biāo)本，結(jié)合形態(tài)學(xué)，進(jìn)行鲌屬魚類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究。