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    印尼虎魚RAD-seq數(shù)據(jù)中微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選及特征分析

    2019-07-26 06:58:16屈政委宋紅梅汪學(xué)杰牟希東胡隱昌
    淡水漁業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:堿基核苷酸印尼

    屈政委,宋紅梅,汪學(xué)杰,劉 奕,牟希東,劉 超,胡隱昌

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣州 510380;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

    印尼虎魚,又名印尼擬松鯛(DatnioidesPulcher),隸屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)松鯛科(Lobotidae)擬松鯛屬(Datnioides),俗稱印尼虎魚,主要分布于湄南河流域、湄公河流域以及印尼蘇門答臘的婆羅洲西部,是當(dāng)?shù)匾环N非常珍稀的物種。印尼虎魚因其紋路深邃,對(duì)比分明,身板寬厚有力,捕食間隙展示了它的力量之美,因而備受人們喜愛,本世紀(jì)初作為觀賞魚引入我國(guó),常與龍魚同池養(yǎng)殖,寓意“龍爭(zhēng)虎斗”。然而虎魚價(jià)格一直居高不下,關(guān)于其遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)生物學(xué)等研究嚴(yán)重匱乏,虎魚存在雌雄難以辨別、雌雄發(fā)育成熟時(shí)期不一致等特點(diǎn),在國(guó)內(nèi)也尚未有人工繁殖成功的報(bào)道,在雌雄鑒別、親本鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)等方面資料甚少,僅有線粒體數(shù)據(jù)分析[1],急需填補(bǔ)相關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

    簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)又稱微衛(wèi)星序列,是由長(zhǎng)度為1~6 bp的重復(fù)單元和側(cè)翼序列組成的DNA序列串,而根據(jù)其開發(fā)的DNA分子標(biāo)記具有共顯性、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、遍布整個(gè)基因組等特點(diǎn)。自20世紀(jì)70年代發(fā)展起來,已被廣泛應(yīng)用到動(dòng)植物的遺傳研究中,隨著更多物種轉(zhuǎn)錄組等基因組數(shù)據(jù)的獲得,SSR標(biāo)記應(yīng)用于布什羅非魚(Tilapiabuttikoferi)[2]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[3]、鯽(Carassiusauratus)[4]等水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳圖譜、遺傳多樣性、遺傳進(jìn)化、親緣關(guān)系分析等方面研究也多有報(bào)道。近年來,依據(jù)磁珠富集法及EST及數(shù)據(jù)開發(fā)和挖掘SSR標(biāo)記的方法廣泛被采用,如孔杰等采用磁珠富集法開發(fā)長(zhǎng)臀鮠(Cranoglanisbouderius)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記27對(duì)[5],曹柱等采用磁珠富集法開發(fā)方正銀鯽(C.auratusgibelio(Bloch))具有多態(tài)性位點(diǎn)的微衛(wèi)星標(biāo)記30對(duì),并進(jìn)行群體驗(yàn)證[6]。此后,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法也在動(dòng)植物中被大量報(bào)道,如銀鲴(Xenocyprisargentea)[7]、紅鯛(Lutjanuscampechanus)[8]、鮸(Miichthysmiiuy)[9]、烏鱧(Channaargus)[10]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[11]、馬氏珠母貝[12]、臘梅(Chimonanthuspraecox)[13]等的SSR標(biāo)記開發(fā)。然而轉(zhuǎn)錄組相對(duì)成本較高,目前,印尼虎魚尚未獲得全基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),甚至也沒有擬松鯛科近源物種的可參考全基因組序列。

    近年來,在第2代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展而來的RAD測(cè)序技術(shù)(Restriction-site-associated DNA sequencing)應(yīng)運(yùn)而生,利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切,并對(duì)酶切片段進(jìn)行高通量測(cè)序,所實(shí)現(xiàn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)被逐步運(yùn)用。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)極大的降低基因組的復(fù)雜度,且不受參考基因組的限制,無(wú)參考基因組的物種也可以使用該技術(shù)進(jìn)行大量的 SNP 和 SSR 標(biāo)記開發(fā),測(cè)序成本也顯著降低、準(zhǔn)確率高[14-15]。采用此方法,已經(jīng)在煙草[16]、大刺鰍[17]、異型花[18]等其他動(dòng)植物中開發(fā)出 SSR 標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳研究。本研究采用RAD-seq技術(shù),對(duì)印尼虎魚進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序,分析SSR位點(diǎn)的數(shù)量、基序類型、基序重復(fù)次數(shù),開發(fā)印尼虎魚微衛(wèi)星標(biāo)記,篩選具有多態(tài)性的SSR引物,為印尼虎魚擬松鯛魚類多態(tài)性SSR的篩選和遺傳研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)群體和基因組DNA的提取

    試驗(yàn)魚取自廣州珠江水產(chǎn)研究所觀賞魚基地,試驗(yàn)魚三尾,采樣后取鰭條在4 ℃冰箱中放置,過夜后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用試劑?TIANamp Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取基因組DNA。

    提取過程:每尾魚取約0.03 g組織,加400 μL裂解液,用勻漿機(jī)將樣品充分研磨。室溫10 000 r/min離心1 min,倒掉上清液,加200 μL緩沖液GA,震蕩至徹底懸浮。隨后再加20 μL 20 mg/mL蛋白酶K,混勻后55 ℃恒溫水浴,水浴過程中上下顛倒加速溶解,至組織消解完全,簡(jiǎn)短離心。加200 μL緩沖液GB,充分顛倒混勻,70 ℃水浴10 min,混合液變得清亮后,簡(jiǎn)短離心。加200 μL無(wú)水乙醇,充分震蕩15 s,簡(jiǎn)短離心。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中,室溫12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液。向吸附柱中加500 μL緩沖液GD,室溫12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液。向吸附柱中加600 μL漂洗液PW,室溫12 000 r/min離心30 s,倒掉廢液。12 000 r/min離心2 min,倒掉廢液,室溫下晾干至無(wú)乙醇味。將吸附柱放在新的離心管中,加30 μL雙蒸水靜置數(shù)分鐘充分溶解,12 000 r/min離心2 min,將DNA收集到離心管中。所提取的模板DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠定性檢測(cè),再用酶標(biāo)儀定量檢測(cè),經(jīng)檢測(cè)OD260/OD280的比值以及模板DNA濃度符合作為模板DNA的條件,保存在-20 ℃中備用。

    1.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

    利用RAD-seq測(cè)序技術(shù),對(duì)印尼虎魚的基因組DNA進(jìn)行簡(jiǎn)化測(cè)序。簡(jiǎn)易流程如下:采用6堿基酶EcoRI進(jìn)行RAD酶切建庫(kù),Paired-End100策略上機(jī)(Illumina HiSeq2000)進(jìn)行高通量測(cè)序,測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行RAD tag(標(biāo)簽)的聚類,產(chǎn)生組裝apire-end read(read 2),通過contig檢測(cè)和組裝得到長(zhǎng)度約300 bp的酶切相關(guān)contig,用以開發(fā)SSR標(biāo)記。

    1.3 基因組SSR位點(diǎn)的篩選和引物設(shè)計(jì)

    利用MISA軟件(MicroSatellite identification tool,http://pgrc.ikp- gatersleben.de/misa)在read 2覆蓋的參考基因組序列中進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索,搜索標(biāo)準(zhǔn)為單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)次數(shù)分別在15、6和5次及以上,四、五、六堿基重復(fù)類型在4次及以上,相鄰的SSR序列不少于100 bp。根據(jù)SSR位點(diǎn)兩翼序列,利用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物,數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取100對(duì)微衛(wèi)星引物,由廣州擎科生物技術(shù)公司合成。對(duì)虎魚基因組DNA樣品(6個(gè)樣品)進(jìn)行序列分析,若在測(cè)序個(gè)體間存在重復(fù)差異即為多態(tài)性SSR。

    1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

    PCR反應(yīng)為25 μL體系:酶0.25 μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL,4×dNTP 0.5 μL,10 μmol/L上游引物0.5 μL,10 μmol/L下游引物0.5 μL,模板cDNA 0.5 μL,加無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,Tm退火30 s(退火溫度視情況而定),72 ℃延伸1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,然后再通過銀染得到目的條帶。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 印尼虎魚簡(jiǎn)化基因組序列產(chǎn)出的檢測(cè)

    印尼虎魚RAD-seq結(jié)果顯示,數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得總長(zhǎng)度為1.96 Gb,具有13 427 412個(gè)干凈讀長(zhǎng)(clean reads)的原始數(shù)據(jù)(表1),對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、過濾,共獲得13 308 806個(gè)高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)(HQ clean reads),平均Q30(測(cè)序堿基質(zhì)量值,即測(cè)序時(shí)錯(cuò)誤識(shí)別的概率為0.1%、正確率為99.9%的堿基比例)為93.31%,平均的GC含量為42.72%。從表1得知,過濾前后差異不大,Q30處于較高水平,表明測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠性,GC含量稍低,但對(duì)此次測(cè)序反應(yīng)的影響不大。

    表1 RAD-seq 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

    2.2 印尼虎魚簡(jiǎn)化基因組中的SSR位點(diǎn)頻率和分布特征

    此次RAD-seq獲得的干凈讀長(zhǎng)(clean reads)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組組裝,read2拼接所得平均長(zhǎng)度333 bp大小的片段163 510個(gè),利用MISA軟件在reads覆蓋區(qū)域中查找SSR位點(diǎn),在樣本中共有21 259個(gè)reads含有SSR位點(diǎn),共檢測(cè)到26 359個(gè)SSR位點(diǎn), SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率(含SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)與read2的contig總個(gè)數(shù)的比值)為16.1%。這些SSR位點(diǎn)中,完全重復(fù)型(P型)所占比例最大,共計(jì)20 616個(gè),占位點(diǎn)總數(shù)的78.21%;復(fù)合型(C型)只有3 105個(gè),占位點(diǎn)總數(shù)的11.78%。

    26 359個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)由496種重復(fù)基序組成(表2),主要分布在三、四、五堿基重復(fù)類型中,分別有57、173和199種,占基元總數(shù)比為11.49%、34.88%和40.12%。而單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)的基元種數(shù)共4種(即ATCG四種堿基),六核苷酸重復(fù)基元種數(shù)為51種,所占基元總數(shù)比例為10.28%。

    2.3 SSR的位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)與序列類型

    印尼虎魚不同類型SSR位點(diǎn)中單核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)集中在15~20次,二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在6~13次和5~9次,四核苷酸基元在4~6次,而五核苷酸和六核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)4~5次;以6次基元重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)數(shù)最高,達(dá)到5 214個(gè)SSR位點(diǎn),占總SSR位點(diǎn)數(shù)19.78%;7次和8次重復(fù)次數(shù)分別為3 076和2 176個(gè)SSR位點(diǎn),占總SSR位點(diǎn)數(shù)11.67%和8.26%。另外,隨重復(fù)次數(shù)的增加各個(gè)位點(diǎn)類型出現(xiàn)的頻率逐漸下降。通過分析所得到的SSR數(shù)目的具體結(jié)果列入表3。

    表2 印尼虎魚基因組-微衛(wèi)星位點(diǎn)的分布信息

    表3 印尼虎魚基因組中 SSR 位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)分布

    如表3所示,SSR位點(diǎn)中二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高,達(dá)19 492個(gè),占位點(diǎn)總數(shù)的73.95%;其次是單核苷酸類型和三核苷酸類型差別不大,分別為2 209(8.38%)和2 271個(gè)(8.62%);四核苷酸類型為1 847個(gè)(7.01%);五核苷酸和六核苷酸類型最少,分別僅有479(1.82%)和61個(gè)(0.23%)。此外,有3 105個(gè)位點(diǎn)以復(fù)合重復(fù)形式出現(xiàn),多態(tài)性SSR數(shù)目為2 783個(gè)。

    圖1 基元類型比例圖Fig.1 Primitive type scale

    在SSR重復(fù)序列中,二堿基重復(fù)序列所占比最大,主要有AC/GT、AG/CT、AT/AT三種重復(fù)序列,其中AC/GT重復(fù)序列16 040個(gè),占比最高為總數(shù)的60.9%,其次為AG/CT重復(fù)序列3 027個(gè),占11.5%,最后是AT/AT重復(fù)序列374個(gè),所占比例為1.4%;其次是單堿基重復(fù)序列,主要有A/T、C/G兩種重復(fù)類型,其中A/T重復(fù)序列1 998個(gè),所占比例較大,比例為7.6%,C/G重復(fù)序列211個(gè),占比為0.8%。三堿基重復(fù)序列包含6種重復(fù)類型,分別為AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATG、AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG,各個(gè)序列的數(shù)目分別為339、364、348、381、468、179,所占比例分別為1.3%、1.0%、1.3%、1.4%、1.8%、0.7%;四堿基重復(fù)序列包括4種重復(fù)類型,分別為AAAC/GTTT、AAAT/ATTT、ACAG/CTGT、AGAT/ATCT,每個(gè)重復(fù)序列的數(shù)目分別為344、305、215、211,所占比例分別為1.3%、1.2%、0.8%、0.8%;五堿基重復(fù)序列和六堿基重復(fù)序列共有1 665個(gè),占序列總數(shù)目的6.3%。除二堿基重復(fù)類型外,A/T重復(fù)序列占比7.6%最大,其他類型的基元占比相差無(wú)幾,大部分在1%左右。各基元頻率分布見圖1。

    2.4 多態(tài)性SSRs標(biāo)記的序列信息

    利用Primer 3.0軟件對(duì)26 359個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),成功設(shè)計(jì)出20 066對(duì)SSR引物,引物設(shè)計(jì)成功率為76.13%;根據(jù)印尼虎魚簡(jiǎn)化測(cè)序數(shù)據(jù),初步發(fā)現(xiàn)其中有2 783對(duì)引物的SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性,多態(tài)性比例為13.9%。隨機(jī)選擇100對(duì)可能具有多態(tài)性位點(diǎn)的SSR引物,對(duì)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證。有92對(duì)引物在檢測(cè)樣品中均能擴(kuò)出清晰的條帶,其中有 20對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性。具有多態(tài)性的20對(duì)SSR引物信息及驗(yàn)證結(jié)果如表 4 所示。

    表4 20對(duì)多態(tài)性SSRs引物信息

    3 討論

    本研究在21 259個(gè)reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測(cè)到完全重復(fù)型(P型)和復(fù)合型(C型)兩種SSR位點(diǎn)共計(jì)26 359個(gè),其中P型20 616個(gè),所占比例最大(78.21%),C型只有3 105個(gè),占位點(diǎn)總數(shù)的11.79%。在所有SSR位點(diǎn)中二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高,達(dá)73.95%,這與其他動(dòng)植物基因組中SSR位點(diǎn)的分布特征相符[16,19,20],其他物種中大多數(shù)都是二堿基重復(fù)類型占據(jù)主體地位,但二堿基比例如此高的并不多見。如對(duì)牙鲆(Paralichthysolivaceus)EST資源的SSR信息分析中,二堿基重復(fù)類型所占比例為59.02%[21]。從目前報(bào)道的結(jié)果來看,馬氏珠母貝的EST-SSR也是以二核苷酸重復(fù)類型為主(48.5%)[12],而在縊蟶(Sinonovaculaconstricta)EST-SSR分布特征及引物開發(fā)利用研究中卻是以三核苷酸重復(fù)類型為主(37.13%)[22]。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槊艽a子以三核苷酸為功能單位,在翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)生基因突變而造成三核苷酸的位移,但沒有對(duì)一個(gè)表達(dá)基因的閱讀框造成太大的影響[23]。

    在SSR 位點(diǎn)重復(fù)類型上,本研究中印尼虎魚的二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高,這與多數(shù)物種中以二核苷酸重復(fù)類型為主的結(jié)果一致[21];在SSR基序的結(jié)構(gòu)方面,共發(fā)現(xiàn)496種基序,各核苷酸類型中以A/T、AC/GT、AG/CT、AGG/CCT 、AGC/CTG、AAAC/GTTT基序最為豐富,這與烏鱧、斑鱧、鳙魚等SSR位點(diǎn)特征相似[10,24],在重復(fù)類型分布上,單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸均表現(xiàn)出一定的偏倚性,如單核苷酸重復(fù)類型中A/T重復(fù)序列1 998個(gè),而C/G重復(fù)序列只有211個(gè),在二核苷酸重復(fù)類型中AC/GT占主要優(yōu)勢(shì),三堿基重復(fù)類型中最多的是AGG/CCT,二、三核苷酸重復(fù)類型在不同物種間差異較大[6,17],這種重復(fù)單元的偏倚性和重復(fù)類型的差異與種間差異性有關(guān)[5,22]。

    SSR位點(diǎn)的多態(tài)性與重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系[25]。本研究中獲得的SSR位點(diǎn)中,單核苷酸基元類型重復(fù)次數(shù)集中在15~20次,二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在5~13次,隨重復(fù)次數(shù)的增加各個(gè)位點(diǎn)類型出現(xiàn)的頻率逐漸下降。為找到具有多態(tài)性的位點(diǎn),本研究挑選的基元類型中,二核苷酸類型重復(fù)次數(shù)≥6、三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5、四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥4,錦鯉選取重復(fù)單元次數(shù)較高的序列進(jìn)行篩選。挑出100對(duì)SSR引物,以6個(gè)印尼虎魚樣本基因組DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,其中肯定能擴(kuò)增出目的片段的引物有73對(duì),剩余27對(duì)未擴(kuò)增出條帶或擴(kuò)增出非目的片段。73對(duì)有效擴(kuò)增的引物中有20對(duì)具有多態(tài)性,初步開發(fā)的20個(gè)具有多態(tài)性的SSR位點(diǎn),可用于擬松鯛魚類的群體遺傳背景分析,同時(shí)本研究也證實(shí)了通過RAD-seq技術(shù)開發(fā)印尼虎魚SSR標(biāo)記的可行性。

    4 結(jié)論

    本研究采用RAD-seq首次對(duì)印尼虎魚樣本進(jìn)行了測(cè)序,共獲得13 308 806個(gè)高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)(HQ clean reads),通過序列分析,在21 259個(gè)reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測(cè)到26 359個(gè)SSR位點(diǎn),主要以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型為主。從中隨機(jī)選二、三、四核苷酸重復(fù)類型微衛(wèi)星位點(diǎn)100個(gè),合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,可穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的有73對(duì),其中20對(duì)具有多態(tài)性。

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    Coco薇(2017年10期)2017-10-12 19:40:13
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