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    豬瘟單克隆抗體診斷技術(shù)的推廣與應(yīng)用

    2019-07-26 01:53:18麥麗芳
    中國畜禽種業(yè) 2019年7期
    關(guān)鍵詞:單克隆單抗豬瘟

    麥麗芳

    (廣東省惠州仲愷高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 516006)

    1 單克隆抗體的主要作用

    20 世紀初期,細胞融合技術(shù)得到第一個單克隆抗體,單抗的問世為各種病害的診斷、預防和治療提供了強有力的技術(shù)措施。經(jīng)試驗比較可以發(fā)現(xiàn),單抗純度高、活性單一,與抗原結(jié)合后能無限繁殖,形成強的特異性,可識別多種新型表位,可識別抗原等優(yōu)點,在治療性候選藥物及診斷試劑盒開發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

    2 豬瘟疫情介紹

    2.1 流行病學

    豬為豬瘟唯一易感群體,致病病毒可隨糞便、分泌物等排到體外,散布在外界形成傳染載體。近些年,典型豬瘟病例漸少,而非典型性豬瘟占大多數(shù)。臨床表現(xiàn)持續(xù)感染,隱性傳染,混合感染。妊娠母豬感染,多數(shù)癥狀不突出。但會伴發(fā)明顯的繁殖障礙病。

    2.2 臨床癥狀

    急性:發(fā)病急,高熱稽留,突然發(fā)病。多數(shù)發(fā)病后 1~2d即可死亡。此病流行初期便秘,后期下痢。檢查排出糞便有大量血絲或黏液。個別病例伴發(fā)典型神經(jīng)癥狀。

    慢性:臨床以纖維性壞死性腸炎為典型癥狀,癥狀較急性類似,但癥狀時好時壞??梢姲Y狀食欲不振、貧血、消瘦,便秘與腹瀉交替出現(xiàn),皮膚有大小不等的壞死斑。多數(shù)病程在30d 以上,個別病例因體質(zhì)問題導致病情惡化甚至死亡。

    2.3 豬瘟的檢測

    獸醫(yī)在豬瘟臨床診斷中主要根據(jù)測試體溫、臨床發(fā)病情況、特點、傳播方式、易感動物、死后剖檢觀察的病理變化可做初步診斷。而確診需要結(jié)合實驗室診斷而進行,參見附表。

    通常情況下,豬瘟免疫控制階段以血清學檢測為主,監(jiān)測凈化階段以病原學檢測為主??贵w檢測用于了解機體免疫功能及豬瘟的免疫保護水平,病原學檢測用于確診豬瘟病毒野毒感染。血清學檢測方法優(yōu)先選用ELISA 方法或其他經(jīng)試劑比對和有效驗證可靠的方法。病原學檢測應(yīng)選用敏感性等于或高于RT-PCR 的方法。

    諸多檢測應(yīng)用方法中,豬瘟單克隆抗體在豬瘟防疫各階段應(yīng)用的頻率最大,而且取得優(yōu)于多克隆抗體的監(jiān)測效果。

    附表 豬瘟診斷指標和發(fā)病情況匯總表

    3 關(guān)于豬瘟單克隆抗體

    抗體是分子識別的重要載體,被普遍應(yīng)用到各豬病的診斷實踐中。而單克隆抗體是通過將抗原注入宿主動物體內(nèi)啟動機體免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的。因而制作單克隆抗體的大多數(shù)操作都是在體外將來自這些宿主的脾細胞與培養(yǎng)的惡性骨髓瘤細胞進行融合。將獨特的細胞克隆分離出來,融合步驟中存活下來的細胞稱為雜交瘤。雜交瘤因骨髓瘤特性而可以永生,且容易在培養(yǎng)物中繁殖。

    不同于多克隆抗體,單克隆抗體用于豬瘟診斷體現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)越性:第一,在體外生存環(huán)境中,雜交瘤存活時間更長,在傳代生長中能持續(xù)形成高均一、高特異抗體。第二,提純不純抗原,獲得高特異的抗體,提升識別檢測的準確性。第三,能獲得無限量的均一抗體,尤其適合抗體標記的免疫學分析,區(qū)別于多克隆抗體檢測效果更好。

    但也有缺點,第一,單克隆抗體制備成本更高些,技術(shù)更復雜,篩選難度更大,使用價格更高。第二,單克隆抗體診斷技術(shù)存在明顯的局限性,生物活性的親和性和局限性大大限制其應(yīng)用范圍,尤其不能用于沉淀和凝聚反應(yīng)的實驗室診斷。

    4 豬瘟單克隆抗體診斷技術(shù)的推廣

    4.1 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗原診斷

    張富強等以單克隆抗體為包被抗體,以噬體表位為競爭指示劑,以標記HRP 為檢測抗體,由此而建立起的競爭ELISA方法。在后續(xù)推廣試驗中,用于70 份的血清樣品監(jiān)測,證實較國家標準的抗原捕捉ELISA 方法敏感性更高。同時,推廣應(yīng)用的試劑中很多不含有病毒成分,不具有傳染性,可作為常規(guī)檢測方法加以推廣。張長弓等用膠體金標識單克隆抗體研發(fā)豬瘟膠體金快速監(jiān)測技術(shù)。在推廣試驗中,該試紙用于弱毒活疫苗和脾淋弱毒苗的檢測,均顯示為陽性。而其他豬源病毒的檢測均顯示陰性,證實該試紙用于豬瘟抗原診斷的高敏性。此外,考慮到該單克隆抗體與野毒有很大區(qū)別,為在區(qū)分野毒抗體方面存在很大差異[1]。陸芹章等用CSFV 單克隆抗體成立抗原診斷方法。在比較一元和二元單抗的檢測比較中很好地證實二元的協(xié)作能力更強,更有利于捕捉病毒,用于鑒別診斷。De las Mulas 等及Narita 等利用針對E2 糖蛋白的單抗建立了檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中豬瘟病毒抗原的免疫組織化學方法。該方法的優(yōu)點是能檢測長期保存的樣品,缺點是比較費時,而且福爾馬林固定后的組織不能再進行病毒分離[2]。劉建文等以3 株CSFV 特異性單抗聯(lián)合作為捕捉抗體,建立了檢測CSFV 抗原的AC-ELISA,單抗的聯(lián)合應(yīng)用提高了該方法的敏感性,對31 份臨床樣品進行平行檢測,該方法與病毒分離和RT-PCR 方法的符合率分別為86.2%和90.3%。該方法將單抗特異性和ELISA 方法的敏感性有機地結(jié)合起來,能短時間內(nèi)準確、快速、直接檢測大批量樣品中CSFV 抗原,且明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法,更適合于各級獸醫(yī)研究機構(gòu)和生產(chǎn)單位應(yīng)用。由于3 株單抗與BVDV 無交叉反應(yīng)性,也可達到與BVDV 鑒別診斷的目的。

    4.2 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗體診斷

    劉勁松等用酶標記CSFV 抗體建立的競爭ELISAD 法,試驗用5 份未吃乳仔豬血清和79 份疫苗注射不同生豬的血清監(jiān)測。結(jié)果顯示,注射前血清母源抗體抑制率在50.8%,注射后2 周母源抗體抑制率在60.8%,與HRP-SPA-ELISA 的檢測結(jié)果呈正相比關(guān)系。由此可見,豬瘟病毒抗體檢測能準確反應(yīng)疫苗注射前后抗體水平和免疫水平。梁冰冰等用豬瘟重組E2 蛋白作為競爭抗體,建立一種能有效檢測抗體的E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法。經(jīng)試驗比較,該檢測結(jié)果與IDEXX 公司的試劑檢測吻合度高達90%以上。同時,測得的抑制率更呈正相關(guān)。由此可證實,E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法,能更高效定量檢測出免疫后的中和抗體水平,適合用于初期抗體水平的流行情況檢測。國外學者Claqvijo 等嘗試用豬瘟E2 基因表達產(chǎn)物制備單克隆抗體,經(jīng)該種方法成立的競爭ELISA 方法在臨床試驗比較的2000 多份血清檢測中證實有效的特異性反應(yīng)和敏感性反應(yīng)分別達到100%和85%。另外,考慮到該單抗不具備中和性,可用此法推廣到豬瘟病的監(jiān)測和流行病學調(diào)查。

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