核桃莖段器官離體再生培養(yǎng)

陳曉明，韋璐陽，蔡 玲，梁文匯，賀佳君，陳代喜

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)和草原局中南速生材繁育實驗室 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，南寧 530002；2.廣西亞熱帶作物研究所，南寧530001；3.廣西鳳山縣水果生產(chǎn)管理局，鳳山 547600）

中國是核桃（Juglans regia）栽培起源地之一，在我國已有2000多年的人工栽培歷史。雖然核桃起源于北溫帶地區(qū)，但對氣候適應(yīng)性強(qiáng)，在我國亞熱帶和熱帶地區(qū)的27個省、市、自治區(qū)均有廣泛分布和大面積栽培，是我國重要的闊葉經(jīng)濟(jì)木本樹種之一[1-2]。核桃營養(yǎng)豐富，富含人體所需的18種氨基酸、有益脂肪酸、多種礦質(zhì)營養(yǎng)、維生素和豐富的卵磷脂[3]。當(dāng)前，全國各地大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，然而大規(guī)模栽培核桃，培養(yǎng)大量具有優(yōu)良性狀的種苗是前提。在長期栽培和人為選擇過程中，我們獲得了很多核桃優(yōu)良品種和類型，但是不完善的繁殖技術(shù)阻礙了核桃優(yōu)良品種的推廣。傳統(tǒng)的核桃苗木繁殖，一般采用嫁接的方法，存在繁殖系數(shù)低、速度慢、成活率不穩(wěn)定、受穗條數(shù)量限制等不利因素[4]。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，核桃組培苗遺傳穩(wěn)定性好，生產(chǎn)周期大大縮短，為核桃的良種苗木規(guī)?；a(chǎn)提供巨大的潛力。近年來，雖然有用核桃莖段進(jìn)行離體快繁技術(shù)的研究，但不同的核桃品種需要的營養(yǎng)和植物激素的濃度均有較大差異[5-10]。本研究通過對核桃組培系列技術(shù)中的營養(yǎng)元素與植物生長激素的調(diào)節(jié)，建立本地核桃優(yōu)良品種“鳳優(yōu)1號”高效、可靠的核桃莖段離體快繁體系，為大規(guī)模良種繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年9月在廣西河池鳳山縣金牙鄉(xiāng)坡茶村“鳳優(yōu)1號”10～15年生的核桃林中進(jìn)行優(yōu)株選擇，選擇年均產(chǎn)干果5 kg以上的健康成年樹為優(yōu)良單株，11月對優(yōu)良單株進(jìn)行肥水管理，每株施氮磷鉀含量各為15%的復(fù)合肥1 kg，促進(jìn)樹體生長。枝條在翌年的2月份開始萌動生長。分別在3月、4月和5月采集優(yōu)株樹冠中上部外圍健壯的當(dāng)年生枝條，枝條采集后放保溫箱冷凍保鮮、保濕，帶回實驗室備用。

1.2 外植體滅菌

用50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍浸泡莖段2 h，初步滅菌，然后用10%（V/V）表面活性劑吐溫-80浸泡30 min，用無菌蒸餾水洗滌，再用0.1%（W/V）氯化汞溶液處理8～13 min，最后用無菌蒸餾水洗滌5次，用無菌濾紙吸干水分后，接種到DKW+0.5 g/L硫代硫酸鈉培養(yǎng)基中。每個處理接種60個外植體，培養(yǎng)15 d后觀察無菌活體得率。

1.3 初代培養(yǎng)

以DKW為基本培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素6-BA的濃度分別為0.5、1和2 mg/L，各處理均添加0.05 mg/L IBA、3%蔗糖和4.5 g/L瓊脂，選取滅菌14 d后無菌活體接種到以上各處理中，每處理接種10瓶，每瓶1個莖段，3次重復(fù)。于1 500 lx光照下培養(yǎng)，肉眼觀察到分化生長的芽時定為外植體始芽萌動，30 d進(jìn)行誘導(dǎo)率的統(tǒng)計。

1.4 增殖培養(yǎng)

選擇6-BA、IBA和基本培養(yǎng)基為試驗因素，試驗用L9（34）正交表試驗設(shè)計，6-BA的試驗水平為0.2、0.5、1.0 mg/L；IBA的試驗水平為0.05、0.1、0.2 mg/L；基本培養(yǎng)基的3個試驗水平為MS、DKW、SH。共設(shè)計9個處理，每處理接種無菌芽5顆，3次重復(fù)，于2 000 lx光照下培養(yǎng)，30 d統(tǒng)計各處理的增殖率，以有一片展開小葉的小芽為統(tǒng)計對象。芽增殖系數(shù)＝增殖后芽總數(shù)/接種芽數(shù)。

1.5 離體生根

以1/2 SH+2%蔗糖+5.0 g/L瓊脂+0～10mg/L IBA為生根培養(yǎng)基，每處理接種10瓶，每瓶3個單芽，共進(jìn)行3次重復(fù)。先在室內(nèi)自然光照條件下培養(yǎng)7 d，然后在室內(nèi)2 000 lx的光照條件下培養(yǎng)28 d。

1.6 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基均添加0.5 g/L硫代硫酸鈉，以減輕褐化對核桃生長的影響。除了初代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)前7 d外，其余的均在16/8 h（光/暗）光周期、光照強(qiáng)度2 000 lx（LED光源）、室溫（25±2）℃的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.7 統(tǒng)計分析

定期記錄芽再生率、芽增殖率、莖長和生根情況，數(shù)據(jù)處理和圖表制作采用Excel 2007完成，用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集和消毒時間對外植體滅菌效果的影響

采用0.1%HgCl2分別對3、4和5月份采集的外植體進(jìn)行表面滅菌處理，3個月份的外植體均隨著處理時間的延長，污染率呈下降的趨勢（表1）。從無菌褐死數(shù)來看，延長消毒時間雖然污染率降低，但無菌褐死數(shù)增加。因此，外植體的滅菌效果需要綜合考慮污染率和無菌褐死數(shù)，污染率低、無菌褐死數(shù)也低才為最佳的消毒方案。3月和4月份采集的外植體，當(dāng)0.1%HgCl2處理時間為10 min時滅菌效果最佳，無菌活體得率分別為36.0%和34.0%，顯著高于其它2個滅菌時間的處理。5月份采集的外植體滅菌時間在10 min和13 min的效果差異不顯著，無菌活體得率均為28.33%。從同一滅菌時間看，不同月份外植體的污染率和無菌褐死數(shù)均不同，隨著采集月份的增加，滅菌效果變差，但無菌褐死數(shù)降低。

2.2 細(xì)胞分裂素6-BA對外植體始芽誘導(dǎo)的影響

細(xì)胞分裂素6-BA對莖段初始芽的誘導(dǎo)有顯著的作用[7,9]。細(xì)胞分裂素6-BA對核桃腋芽誘導(dǎo)有較大影響，3月份采集的外植體當(dāng)6-BA濃度增加到1.0 mg/L時，腋芽誘導(dǎo)率為40.21%（表2）。4月和5月份采集的外植體，6-BA濃度為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)率分別為40.12%、50.33%；6-BA濃度增加到1.0 mg/L時，誘導(dǎo)率與6-BA濃度為2.0 mg/L時的差異不顯著；誘導(dǎo)的腋芽在含6-BA 1.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長健壯、葉色濃綠，沒有出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，6-BA濃度為2.0 mg/L時，腋芽相對于1.0 mg/L表現(xiàn)出芽段粗，一半腋芽呈玻璃化狀態(tài)。3月份采集的外植體在2.0 mg/L的濃度時同樣出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。由此可知，核桃莖段外植體始芽誘導(dǎo)需要一定濃度的6-BA誘導(dǎo)才能獲得理想的腋芽。本試驗條件下的6-BA濃度為1.0 mg/L時，可得到較高質(zhì)量的始芽進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)。

表1 外植體表面滅菌效果Tab.1 Effects of surface sterilization of explants

表2 細(xì)胞分裂素6-BA對外植體初始不定芽誘導(dǎo)和生長的影響Tab.2 Effects of 6-BA on induction and growth of initial adventitious shoots in explants

2.3 基本培養(yǎng)基和激素配比對核桃不定芽增殖的影響

以3種不同基本培養(yǎng)基與不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA和生長素IBA配合使用，研究核桃叢生芽誘導(dǎo)的最佳配方。通過對正交設(shè)計的直觀分析發(fā)現(xiàn)，不同的基本培養(yǎng)基和不同的植物生長調(diào)節(jié)和濃度影響核桃增殖的主次不一。根據(jù)極差的數(shù)值可知（表4），影響核桃不定芽增殖的主要因素是基本培養(yǎng)基，其次是細(xì)胞分裂素6-BA，生長素IBA的影響最小。通過對比T值的大小，可得到各因素的較優(yōu)水平，在基本培養(yǎng)基中以SH為較優(yōu)水平，6-BA濃度的較優(yōu)水平為0.5 mg/L，IBA的較優(yōu)水平是0.1 mg/L。因此，核桃增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為SH+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。表中處理5正好出現(xiàn)了這一組合，其增殖系數(shù)為4.32，顯著高于其它處理。

表3 正交L9（34）試驗安排及結(jié)果分析表Tab.3 Orthogonal L9 （34） experimental arrangement and results analysis

2.4 IBA對核桃不定根誘導(dǎo)的影響

生根試驗以1/2 SH為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度IBA對核桃組培苗生根的影響（表4）。沒有IBA或低水平的IBA濃度（2 mg/L）均不能誘導(dǎo)生根，當(dāng)IBA的濃度增加為5.0 mg/L時，12 d后開始觀察到少部分芽基部露出白色根點，但生根率較低，只有23.57%，且生根的植株一般只有一條根，根較細(xì)長，無愈傷組織出現(xiàn)。當(dāng)IBA濃度增加到8.0 mg/L時，生根率增加到63.18%，每株小苗長2～3條根，根較5.0 mg/L的粗大，開始有少量愈傷組織。IBA濃度加大到10.0 mg/L時，生根率為65.24%，與8.0 mg/L的沒有明顯差異，生根率并沒有隨著生長素濃度加大而明顯增加，而且基部長滿愈傷組織。以上分析表明，在1/2 SH培養(yǎng)基中添加8.0 mg/LIBA，生根效果最佳。

表4 不同濃度IBA對核桃不定根誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different concentrations of IBA on adventitious root induction of Juglans regia

3 結(jié)論與討論

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，無菌活體的得率直接影響到離體培養(yǎng)的進(jìn)程，高比例無菌活體的獲得主要取決于較低污染率和褐死率。因此，合適的滅菌時間是高無菌活體獲得率的關(guān)鍵條件。本研究對3個月份采集的外植體進(jìn)行滅菌處理，獲得的最佳的滅菌時間為10 min。劉昊等[6]用0.1%升汞處理“強(qiáng)旱”核桃莖段的最佳滅菌時間為10 min，污染率與本試驗相當(dāng)。不同木質(zhì)化程度的莖段材料，其萌芽率和褐化率均有差異，在廣西的氣候條件下，4—5月份的當(dāng)年生嫩枝已經(jīng)出現(xiàn)了半木質(zhì)化，試驗結(jié)果表明，半木質(zhì)化莖段的外植體萌芽率和褐化率均優(yōu)于3月份未木質(zhì)化外植體，張小紅等[11]和牛青等[12]也認(rèn)為半木質(zhì)化莖段其褐化率和萌發(fā)率均優(yōu)于未木質(zhì)化嫩莖，與本研究結(jié)論一致。本研究用同樣的滅菌方法，半木質(zhì)化莖段的滅菌效果顯著低于未木質(zhì)化嫩莖，這是由于半木質(zhì)化莖段在野外生長時間相對較長，附著在表面的污染物相對較多造成。為了降低污染率，有學(xué)者提出將所需品種進(jìn)行嫁接后，移入溫室培養(yǎng)相對干凈的枝條，當(dāng)達(dá)到半木質(zhì)化程度后取莖段進(jìn)行滅菌處理[13]。應(yīng)用此方法是否能有效控制外植體污染，有待下一步的驗證。同時，核桃莖段富含酚類物質(zhì)，對外植體進(jìn)行切割時從傷口分泌出的酚類物質(zhì)氧化成醌，使培養(yǎng)物褐化，進(jìn)而破壞培養(yǎng)物的正常分化和生長[14]，有研究表明0.5～1.0 g/L硫代硫酸鈉對抑制莖段外植體褐化效果最好[5,10]。因此本研究所有培養(yǎng)基均添加0.5 g/L硫代硫酸鈉以減輕褐化對核桃生長的影響。大多數(shù)核桃組培研究的結(jié)果表明，DKW是最適合核桃組培的基本培養(yǎng)基[6,9,15-16]，本研究的結(jié)果顯示，SH在鳳優(yōu)1號的表現(xiàn)優(yōu)于DKW或MS。牛青等[12]用MS為基本培養(yǎng)基在金薄香核桃莖段培養(yǎng)中效果最佳，李建軍等[17]也認(rèn)為MS基本培養(yǎng)基適合用于美國黑核桃的組培培養(yǎng)。表明不同的核桃品種其營養(yǎng)需求有較大差異。細(xì)胞分裂素激活外植體節(jié)部的腋芽，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時，可得到較高質(zhì)量的始芽進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)。這可能是適宜的6-BA濃度提高了某些轉(zhuǎn)化酶（如SOD、POD、CAT等）的活性，從而促進(jìn)培養(yǎng)物的生長[7]。本研究還試驗了不同6-BA濃度對芽增殖的影響，在一定濃度范圍內(nèi)，節(jié)間分生組織的芽增殖系數(shù)隨細(xì)胞分裂素濃度的增加而增加。很多核桃在芽增殖過程中對6-BA表現(xiàn)出良好的反應(yīng)。劉昊等[6]用6-BA 1.0 mg/L取得較好增殖效果，苗玉青等[9]用6-BA 1.0 mg/L配合1.0 mg/L IBA，增殖倍數(shù)達(dá)到4.4倍，且苗木生長狀況良好。本研究以SH為基本培養(yǎng)基，0.5 mg/L 6-BA配合0.1 mg/L IBA，增殖倍數(shù)也能達(dá)到4.32倍。

核桃是一種難生根植物[18]，除了奇異核桃的生根率較高外，其他種類的核桃生根率一直較低而且不穩(wěn)定[8]。苗玉青等[9]的“溫18”薄皮核桃品種的生根試驗表明，生根效果最優(yōu)的是1/2 DKW添加5.0 mg/L IBA，生根率雖然可高達(dá)73.3%，但根系愈傷化嚴(yán)重且畸形，這種生根苗移栽基本不能成活。裴東等[19]認(rèn)為IBA是較適合誘導(dǎo)核桃組培苗生根的生長素，外源IBA均可誘導(dǎo)核桃嫩莖的內(nèi)源IAA和ABA升高，從而改變嫩莖內(nèi)源激素平衡狀況，進(jìn)而促進(jìn)不定根的發(fā)生。本研究中誘導(dǎo)生根最佳的IBA濃度為8.0 mg/L，生根率為63%以上，每株小苗能長2～3條根。