響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英總黃酮提取工藝及其抑菌活性

延 永，張亦琳，吳永玲，楊蓉蓉

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

蒲公英（Taraxacumspp.），菊科（Compositae），多年生草本植物，味微苦，平微寒，具有清肺利嗽、消腫散結(jié)和養(yǎng)陰涼血等功效[1]。研究表明，蒲公英具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、保護(hù)胃腸道、調(diào)節(jié)免疫等多種功效[2]。但蒲公英口感不佳，難以添加到日常飲食中。經(jīng)分析，蒲公英所含化學(xué)物質(zhì)種類繁多，含有機(jī)酸、黃酮、揮發(fā)油、三萜類等[3-4]。蒲公英的藥用價(jià)值與其所含黃酮類物質(zhì)有著極大的關(guān)系[5]，對蒲公英進(jìn)行深加工，提取其有效活性成分，在食品、保健品領(lǐng)域加以應(yīng)用，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義[6]。目前，蒲公英提取的溶劑一般為醇類[7]、水[8]等大極性溶劑，提取手段有（加熱）回流[9]、超聲輔助[10]、微波輔助[11]等。綜合對比，乙醇回流提取蒲公英總黃酮具有操作簡便、毒性低、污染少、效率高的優(yōu)點(diǎn)[12]。但是，目前的乙醇回流提取工藝并沒有考慮浸泡對提取效果的影響，有研究表明，中藥材經(jīng)充分浸泡后再加熱煎煮提取有效成分，有助于提高提取得率[13]。

基于此，本研究在傳統(tǒng)回流提取工藝的基礎(chǔ)上，首次增加溶劑浸泡環(huán)節(jié)，通過對提取各單因素進(jìn)行分析和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，希望開發(fā)出方法簡便、提取率高的蒲公英總黃酮提取工藝，并對提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，為蒲公英的開發(fā)利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇為分析純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；NaOH（片狀）、Al（NO3）3、NaNO2均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所）；蒲公英（四川峨眉山市售）。供試菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌由張亦琳博士提供。粉碎機(jī)（HK-02A，廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV-755B，上海分析儀器總廠）；高壓滅菌鍋（YXQ-LS-18SI，上海博迅）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（DHP-9052，上海華鄰）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒲公英總黃酮的提取方法

在250 mL的圓底燒瓶中加入蒲公英粉末（過60目篩）2.0 g，加入確定量溶劑后，浸泡，加熱回流，待體系冷卻后，過濾除去固體廢棄物，濾液為蒲公英總黃酮提取液。

1.2.2 提取液中總黃酮含量測定方法

蒲公英總黃酮含量測定采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法[14]，以吸光度值A(chǔ)為坐標(biāo)軸Y，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）為坐標(biāo)軸X，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，模擬回歸方程：Y=10.88X-0.007 9，R2=0.998 4。測試樣品在濃度0.01～0.08 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

移取5.0 mL提取液于50 mL容量瓶，水定容后，移取1.0 mL至25 mL容量瓶，按照配置蘆丁系列溶液的方法[14]處理樣品。在吸光度510 nm處，測得吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，總黃酮得率Y（%）由下式計(jì)算所得。

式中：Y-總黃酮得率（%）

C-總黃酮濃度（mg/mL）

N-稀釋倍數(shù)

V-提取液取樣量（mL）

W-藥材投入粉末質(zhì)量（mg）

1.2.3 蒲公英總黃酮提取的單因素（各因素）試驗(yàn)

按1.2.1方法提取蒲公英總黃酮，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（70%）、料液比（1∶30 g/mL）、浸泡時(shí)間45 min、回流時(shí)間2.5 h為基礎(chǔ)水平，依次考察蒲公英總黃酮提取工藝中乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、浸泡時(shí)間 （15、30、45、60、75 min）、回流時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）各水平對得率的影響?？疾靻我灰蛩赜绊憰r(shí)，其他因素水平與基礎(chǔ)水平一致，以蒲公英得率為指標(biāo)，繪制各試驗(yàn)因素對蒲公英總黃酮得率的影響曲線圖。

1.2.4 蒲公英總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素測試的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平（表1）。運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，優(yōu)化蒲公英總黃酮提取工藝，以總黃酮得率Y（%）為相應(yīng)參數(shù)，考察各因素水平對其提取的影響，并驗(yàn)證最佳工藝。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.5 MIC和MBC值的測定

參考文獻(xiàn)方法[15-16]測定MIC和MBC值。將蒲公英總黃酮提取物配制成濃度0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL的系列溶液，滅菌條件下，分別量取10.0 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、100.0 μL菌懸液（104～105CFU/mL）和1.0 mL配制的系列溶液于錐形瓶（50 mL）中。37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h后測量吸光度值A(chǔ)（λ=517 nm），當(dāng)A=0時(shí)，對應(yīng)的濃度為MIC值；37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測量吸光度值A(chǔ)（λ=517 nm），當(dāng)A=0時(shí)，對應(yīng)的濃度為MBC值[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英總黃酮提取的單因素（各因素）試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)乙醇濃度由50%增加到60%時(shí)，蒲公英總黃酮提取率大幅提升，在60%時(shí)達(dá)到頂峰（7.32%）（圖1）。繼續(xù)增加乙醇濃度，提取率出現(xiàn)下滑，可能是60%左右乙醇含量溶液的極性與黃酮的極性比較匹配，有利于黃酮類化合物的溶出；液料比達(dá)到1∶40（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大值7.31%。繼續(xù)增大料液比蒲公英總黃酮提取率出現(xiàn)下降趨勢，蒲公英含量過低不利于酮類化合物溶出；浸泡時(shí)間對提取率影響較大，浸泡時(shí)間太短不利于蒲公英黃酮的提取。分析發(fā)現(xiàn)最佳的浸泡時(shí)間應(yīng)該在45 min左右，提取率達(dá)到最大值6.93%；回流時(shí)間對提取的影響與浸泡時(shí)間類似，提取率有明顯增加的過程，2.5 h時(shí)，達(dá)到6.92%（峰值）。繼續(xù)增加到3 h時(shí)，提取率下降，可能的原因是長時(shí)間的高溫回流，破壞蒲公英黃酮的分子結(jié)構(gòu)，以至于提取率減小。

2.2 蒲公英總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

圖1 各試驗(yàn)因素對蒲公英總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of each experimental factor on yield of total flavonoids from Taraxacum

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以蒲公英總黃酮提取率為響應(yīng)值（表2），進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下回歸方程。

總黃酮提取率=7.91+0.32A-0.068B+0.017C+0.024D-0.03AB-0.01AC-0.03AD-0.04BC-0.04BD+0.013CD-1.02A2-0.17B2-0.19C2-0.31D2

表2 蒲公英總黃酮提取率的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Response surface method for extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

響應(yīng)面模擬的模型高度顯著（P＜0.001），方差分析表明該模型可靠性好，失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)測量值與模型預(yù)測值基本一致，R2=0.985 5（表3）。變異系數(shù)CV=1.30，說明試驗(yàn)可操作性較好。應(yīng)用該模型充分?jǐn)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)蒲公英總黃酮的提取率變化與所選變量相關(guān)，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）是高度相關(guān)（P＜0.001），料液比（B（顯著相關(guān)（P＜0.05）。在模型模擬范圍內(nèi)，各因素對蒲公英總黃酮的提取率影響程度大小的順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B）＞回流時(shí)間（D）＞浸泡時(shí)間（C）。

表3 蒲公英總黃酮提取率的方差分析Tab.3 Variance analysis of extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

運(yùn)用Design-expert 8.0.6.1軟件分別繪制各因素的3D響應(yīng)面曲面圖（圖2）。直觀地反映各優(yōu)化因素對蒲公英總黃酮提取率的影響，形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[18]。乙醇體積分?jǐn)?shù)對蒲公英總黃酮提取率影響最大，表現(xiàn)為相關(guān)曲面斜率大（圖2a、2b、2c）。響應(yīng)面圖投影面為等高線圖，等高線的形狀可反映出各因素交互作用的強(qiáng)弱[19]，各試驗(yàn)因子之間均存在較強(qiáng)的交互作用，其等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形狀，與上述回歸方程的方差分析結(jié)果相一致（圖2）。模型預(yù)測最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)61.58%、料液比1∶37.72 g/mL、浸泡時(shí)間46 min、回流時(shí)間2.52 h，總黃酮的理論得率為7.944%。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

結(jié)合試驗(yàn)的可行性，將預(yù)測參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡時(shí)間46 min、回流時(shí)間2.5 h，平行提取3次，蒲公英總黃酮提取率分別為7.96%、7.93%、8.01%，平均值為7.97%（RSD=50.73%），基本與預(yù)測值一致。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明，該工藝具有不錯(cuò)的穩(wěn)定性，與預(yù)測一致。

2.4 MIC和MBC值的測定結(jié)果

蒲公英總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的MIC值分別為8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL（表4）。從MIC值可以看出，蒲公英總黃酮提取物對金黃葡糖球菌和白色念珠菌具有較好的抑制活性，有很高的應(yīng)用價(jià)值，對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等其他6種菌也有一定的抑制活性，但遜色于前二者，表現(xiàn)出明顯耐受性個(gè)體差異。

圖2 兩因素交互作用對總黃酮得率的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of interaction of two factors on yield of total flavonoids

表4 蒲公英總黃酮提取物對8種供試菌種MIC和MBC值Tab.4 Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration of 8 tested strains against total flavonoid extract of Taraxacum

3 結(jié)論

該工藝在乙醇回流提取的基礎(chǔ)上增加浸泡環(huán)節(jié)，通過單因素和響應(yīng)面方法優(yōu)化蒲公英總黃酮的提取工藝，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、浸泡時(shí)間（C）、回流時(shí)間（D）對提取工藝的影響。通過Box-Behnken試驗(yàn)，得到最佳工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡時(shí)間46 min、回流時(shí)間2.5 h，蒲公英總黃酮平均提取率為7.97%（RSD=50.73%）。

抑菌實(shí)驗(yàn)表明：蒲公英總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌8種測試菌均有抑制活性，MIC值分別為8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL。