GaAlAs激光對牙髓中Shh蛋白表達(dá)的影響

呂學(xué)超

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，黑龍江哈爾濱 150001

當(dāng)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體受到損傷時，原發(fā)性牙本質(zhì)連同下層牙髓組織表現(xiàn)出退行性病變。隨著新分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞取代壞死牙本質(zhì)細(xì)胞有助于產(chǎn)生新的礦化組織。在此過程中牙髓干細(xì)胞發(fā)揮了作用，然而其分子機制尚不明確。鎵鋁砷（GaAlAs）半導(dǎo)體激光可以用來加速牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的礦化。有報道在直接蓋髓術(shù)中應(yīng)用GaAlAs半導(dǎo)體激光輔助治療暴露牙髓組織比常規(guī)直接蓋髓成功率高[1]。

Shh蛋白最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，這類分泌性蛋白，能夠自身發(fā)生水解，研究發(fā)現(xiàn)，Shh通路在許多哺乳動物胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，在干細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)干產(chǎn)生、牙胚發(fā)育和骨骼生長發(fā)育等許多生物學(xué)行為中起著調(diào)節(jié)作用[2]。Shh基因僅有1種類型,哺乳動物包括3種同源的類別:分別是Shh、Dhh、Ihh。這3種基因序列體現(xiàn)出高度同源的特征，Dhh能夠參與生殖細(xì)胞的產(chǎn)生及發(fā)育；Ihh對軟骨發(fā)育有影響作用；而在Hedgehog家族中表達(dá)最多的為Shh，發(fā)揮主要的信號傳導(dǎo)功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Shh能夠參與細(xì)胞在肢體、神經(jīng)管及體節(jié)中的分化建立，對神經(jīng)管D-V的發(fā)育模式、胚胎早期的不對稱發(fā)育模式、肢體A-P的發(fā)育模式以及體節(jié)形成模式均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還可參與形成某些器官組織的形態(tài)構(gòu)成，如腦、肺臟、眼、脊索、牙齒、毛發(fā)及四肢等，還與腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān)。通過Shh基因敲除動物的腦、肢體、顱面部及脊索的畸形現(xiàn)象十分突出。因為果蠅中的Hedgehog僅一種，研究具有便利性,因此常把果蠅作為研究對象。雖然說脊椎動物中的形式更多，但研究已證實果蠅的Hedgehog信通路能夠保留在脊椎動物體內(nèi)，因此提示其功能具有某些相似之處[4]。

Shh途徑包括 Shh、CI/GLI二聚體、SMO。Shh作為一種激活劑，可以與特定的細(xì)胞表面受體SMO和修補后的跨膜蛋白連接，起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。SMO是Shh通路的關(guān)鍵激活劑，可以與Shh連接產(chǎn)生復(fù)合物[5]。一般來說，Patched抑制SMO的活性。當(dāng) Shh與Patched結(jié)合時，Patched失去了對SMO的抑制作用。同時，Patched激活轉(zhuǎn)錄因子Ci/Gli二聚體的活性，將激活的Ci/Gli二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，激活Shh信號通路。其中Shh信號通路調(diào)控的下游基因可能包括:Ptc、WNT、BMP2、Msx 等[6]。該實驗（2017年2月—2018年2月）旨在評估GaAlAs激光對牙髓中Shh蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本制備及分組

采用因牙周病拔除的健康第一磨牙（口腔門診獲得）用脈沖810 nm的GaAlAs半導(dǎo)體激光對近中面進(jìn)行照射180 s，輸出功率為1.5 W。在激光照射期間，激光纖維的尖端保持接觸牙面，非照射牙齒作為對照組，分別在照射后的3、7和11 d進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標(biāo)本的固定和包埋①將準(zhǔn)備完畢標(biāo)本裝入脫水試劑盒并放入沖水池子4 h。②將標(biāo)本由按說明書梯度脫水。③二甲苯透明:從100%乙醇溶液中取出樣品，干燥，然后放入二甲苯溶液I中。用二甲苯代替無水乙醇約50 min。樣品在二甲苯中放置約2 h。④標(biāo)本的浸蠟:將已完成的實驗樣品分別放入石蠟中浸潤各兩個鐘頭。⑤包埋:將已經(jīng)溶解的石蠟倒入包埋器中，并將浸好的組織塊切面朝下包埋。

1.2.2 切片 用切片機連續(xù)切片石蠟牙。獲得厚度為5 μm的切片并固定在顯微鏡的載玻片上。

1.2.3 標(biāo)本的嗜伊紅蘇木素(hematoxylineosinstainHE)染色 每個標(biāo)本的一個載玻片均用蘇木精-伊紅染色，經(jīng)過綜合性組織學(xué)分析評定整個冠髓和根髓情況。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用SABC法SHH蛋白免疫組化試劑盒作為武漢博斯特公司的產(chǎn)品。PBS作為空白對照而不是第一個抗體。主要步驟為：常規(guī)脫蠟和水合；用3%過氧化氫去除內(nèi)源過氧化物酶；阻斷正常血清；過夜用1抗體在4℃；加入生物素化2H，ABC復(fù)合體2 h，DAB染色；蘇木精再染色，透明性和密封性。

1.3 圖像分析和統(tǒng)計分析

采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)。利用圖像分析軟件，從實驗組每個陽性染色部位隨機選取9個視場，測定其平均光密度（IOD）。測量并計算了對照組相應(yīng)部位9個視場的平均光密度（IOD）。分別對各組光密度值進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

光密度值結(jié)果見表1，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1~4。

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的統(tǒng)計結(jié)果（±s）

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的統(tǒng)計結(jié)果（±s）

注：各組之間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

指標(biāo) 3 d 3 d 11 d Shh 121.611±8.232 1 121.998±6.512 3 623.545±1.321

圖1 HSP70在對照組中表達(dá)。（×200）

圖2 Shh在照射3 d年輕恒牙牙髓中表達(dá)。（×200）

圖3 Shh在照射7 d年輕恒牙牙髓中表達(dá)。（×200）

圖4 Shh在照射11 d年輕恒牙牙髓中表達(dá)。（×200）

3 討論

GaAlAs半導(dǎo)體激光是一種非磨料激光器。它可以用來加速牙本質(zhì)/牙髓復(fù)合體的礦化。GaAlAs半導(dǎo)體激光輔助治療因齲暴露的牙髓組織報告顯示明顯比常規(guī)直接蓋髓術(shù)成功率高，表明GaAlAs激光作用源于它的去污和止血能力[7]。

Shh能夠參與細(xì)胞在肢體、神經(jīng)管及體節(jié)中的分化建立，對神經(jīng)管D-V的發(fā)育模式、胚胎早期的不對稱發(fā)育模式、肢體A-P的發(fā)育模式以及體節(jié)形成模式均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還可參與形成某些器官組織的形態(tài)構(gòu)成，如腦、肺臟、眼、脊索、牙齒、毛發(fā)及四肢等，還與腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān)。通過Shh基因敲除動物的腦、肢體、顱面部及脊索的畸形現(xiàn)象十分突出[8]。Shh蛋白是Shh家族的重要成員之一。分子量為70 kd。它在牙髓細(xì)胞的耐熱性、分子保護(hù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。結(jié)果表明，在一定程度的預(yù)熱刺激下，SHH-hsp70的表達(dá)增加，可以恢復(fù)牙髓細(xì)胞間的通訊，增強堿性磷酸酶的活性。這些反應(yīng)表明SHH是一種細(xì)胞。保護(hù)因素起著重要作用[9]。

在該研究中，采用了Shh作為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的標(biāo)記物，因為有報道它能直接反應(yīng)這些細(xì)胞在受到如備洞等治療后的變化[10]，在激光照射后第3天，少量新生修復(fù)牙本質(zhì)樣礦化組織出現(xiàn)，觀察到存在Shh陽性的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。在第7天，出現(xiàn)了大量的HSP70陽性的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，修復(fù)性牙本質(zhì)樣牙本質(zhì)層變厚，7 d 達(dá)到高峰（1 121.998±6.512 3）。 在第11天時，一些細(xì)胞內(nèi)含物表達(dá)Shh，而另一些則沒有，修復(fù)性牙本質(zhì)樣牙本質(zhì)層的厚度并沒有明顯的變化，11 d 逐漸消退（623.545±1.321）。

在牙體治療中，拋開適應(yīng)癥的選擇、牙髓的狀態(tài)等原因直接蓋髓術(shù)的失敗率仍然往往非常的高，應(yīng)用GaAlAs半導(dǎo)體激光輔助治療牙體組織疾病不失為一種理想的治療方法。