低出生重對仔豬肝臟抗氧化功能的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

田一航，宋 毅，陳代文，余 冰，何 軍，虞 潔，毛湘冰，羅玉衡，黃志清，羅鈞秋，鄭 萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所/動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，四川 雅安 625014）

遺傳育種技術(shù)的發(fā)展和飼養(yǎng)管理的改善雖然提高了母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)，但是也提高了低出生重（low birth weigh，LBW） 仔豬數(shù)量[1]，自然發(fā)生的LBW 仔豬比例高達(dá) 15%～20%[2-3]。LBW 顯著提高仔豬斷奶前死亡率和發(fā)育不良比例[4]，造成飼養(yǎng)管理所投入的精力和資本增加。宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR） 即哺乳動物妊娠期胚胎或胎兒發(fā)育受阻，是LBW 仔豬產(chǎn)生的主要原因[2，5]。仔豬出生前，生長于氧氣濃度相對較低的子宮，出生后，則會吸入高氧氣濃度的空氣，此轉(zhuǎn)變會引起其氧化還原失衡[6-7]，隨著其抗氧化系統(tǒng)的發(fā)育，氧化還原平衡可逐漸恢復(fù)[8]。LBW 仔豬抗氧化系統(tǒng)的發(fā)育可能異常，表現(xiàn)為抗氧化能力低于NBW 仔豬。與NBW 仔豬相比，IUGR 新生仔豬抗氧化能力顯著降低[9-10]，IUGR 哺乳仔豬肝臟GPx 活性顯著降低，MDA 含量顯著提高[11]，斷奶兩周的LBW仔豬血漿Fe3+還原能力和GPx 活性顯著降低[5]。

Arg 是幼齡哺乳動物所必需的氨基酸，在體內(nèi)既參與蛋白質(zhì)的合成，又是NO、多胺、肌酸和胍丁胺合成的前體[12]。哺乳仔豬出生7日齡到14日齡期間，血液循環(huán)中Arg 及其前體瓜氨酸、鳥氨酸的含量顯著降低[13-14]。前人研究表明，一頭7日齡的哺乳仔豬每天Arg 需要量為2.7 g，而豬乳只能提供1.06 g[15-16]。Arg 有改善仔豬抗氧化功能的作用。研究表明，飼糧添加Arg 顯著降低仔豬血清MDA 含量，緩解斷奶引起的氧化應(yīng)激[17]。飼糧添加Arg 可緩解Diquat 誘導(dǎo)的氧化損傷，增強仔豬的抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激[18]。飼糧添加4%的Arg 顯著降低血清MDA 含量，提高血清 GPx 活力，0.8%的 Arg 顯著提高血清CAT、SOD 和GPx 活力，從而緩解氧化魚油引起的氧化應(yīng)激[19]。

LBW 仔豬抗氧化能力降低，而Arg 有改善仔豬抗氧化功能的作用。因此本試驗通過比較LBW 仔豬和NBW 仔豬肝臟抗氧化能力，并在飼糧中添加Arg 飼喂 LBW 仔豬，考察 Arg 添加對 LBW 哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

本研究包括2 個試驗。所用仔豬從體況相近、胎次相近和產(chǎn)期一致的母豬所產(chǎn)DLY 新生仔豬中選擇，根據(jù)前人研究確定選擇標(biāo)準(zhǔn)[20-21]。試驗1 選取10 對公豬，從同一窩中選到的NBW 和LBW 為1 對，兩組仔豬體重分別為（1.66±0.07）和（0.83±0.04） kg，不吃初乳，2～4 h 內(nèi)麻醉屠宰。試驗 2 從 72 窩仔豬中標(biāo)記出16 頭NBW 仔豬和72 頭LBW 仔豬，待其吃完初乳，4日齡時，再按照體重接近和性別比例一致的原則從標(biāo)記過的仔豬中選取10 頭NBW 和20頭 LBW 仔豬，NBW 仔豬飼喂基礎(chǔ)飼糧，將 20 頭LBW 仔豬分為兩組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和基礎(chǔ)飼糧中添加1.0% L-Arg 的飼糧，均配制成人工乳，各組仔豬初始體重分別為（1.96±0.03）、（1.05±0.04）和（1.05±0.04） kg，飼喂 21 d，試驗第22 天早晨進(jìn)行麻醉屠宰。

1.2 試驗材料

L-Arg 由日本味之素公司提供，純度為99%，LAla 由上海易蒙斯公司提供，純度為99%。

1.3 試驗飼糧

飼糧為人工乳，由代乳粉加水配制而成，按照代乳粉:水=1:4 的比例加40℃溫開水，充分溶解混勻后飼喂。基礎(chǔ)飼糧參考前人[22-23]研究配制，添加1.0%L-Arg 的飼糧是在基礎(chǔ)飼糧中添加1.0%的L-Arg，并通過添加葡萄糖和L-Ala 使兩組飼糧等能等氮，此添加量根據(jù)本課題組前期研究確定，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所科研基地進(jìn)行，所有仔豬單籠飼養(yǎng)于代謝籠中。試驗前對圈舍及代謝籠進(jìn)行全面消毒，試驗第一周溫度控制在31～32 ℃，之后每周降低 2 ℃，相對濕度控制在50%～60%。每天飼喂時間為 06：00，09：00，12：00，15：00，18：00，21：00，24：00，每次以仔豬吃飽為準(zhǔn)。試驗期間不對豬只使用任何抗生素類藥物，其余按基地要求進(jìn)行操作管理。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets %

1.5 樣品采集與處理

屠宰后，迅速打開仔豬腹腔，分離出肝臟，并取適量組織樣裝于凍存管中，錫箔紙包好，投入液氮速凍，并放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 肝臟抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)測定

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，測定肝臟組織中ASA 和AHR 活性，抗氧化酶SOD、GPx活性和MDA 的含量，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。先取約1 g 組織樣品，加入9 倍體積生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min 離心10 min，然后對上清液總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，最后取上清液進(jìn)行各個指標(biāo)的測定，測定結(jié)果定義為，每毫克蛋白質(zhì)中該指標(biāo)的活性或含量。

1.6.2 基因表達(dá)測定

實時定量PCR 法測定哺乳仔豬肝臟基因，包括核因子NF-E2 相關(guān)因子（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）、醌氧化還原酶 1（NQO-1）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 2（IL-2）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、白細(xì)胞介素 10（IL-10）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）的相對表達(dá)量。

總 RNA 的提取按照試劑盒（Trizol Reagent，TakaPa，日本）操作說明進(jìn)行，RNA 質(zhì)量檢測使用核酸蛋白檢測儀 （Beckman DU-800，CA，美國） 于 260 nm 檢測，A260/A280 表示 RNA 的純度，該比值在1.8～2.0 說明 RNA 純度較好。cDNA 的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTMregent kit，TaKaRa，日本），反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存待用。利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）搜索基因序列，運用Primer 5 進(jìn)行引物設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表2。用實時定量PCR 儀（ABI7900HT Real-Time PCR System，ABI，美國）進(jìn)行測定，反應(yīng)熒光染料為SYBR Green I（TaKaRa，日本）。反應(yīng)體系為 10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII（2×），0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，3 μL 雙蒸水，1 μL cDNA 模板。以β-actin 和18sRNA（取兩者CT 值的幾何平均值）為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)首先用Excel 2010 進(jìn)行初步整理，然后使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，新生仔豬采用配對樣本t 檢驗，使用P 表示其顯著性。哺乳仔豬采用獨立樣本t 檢驗，兩兩比較，LBW 哺乳仔豬與NBW 哺乳仔豬比較的顯著性用P1 表示，飼糧添加1.0% Arg 飼喂的哺乳仔豬與LBW 哺乳仔豬比較的顯著性用 P2 表示。以 P＜0.05 為差異顯著，0.05≤P＜0.1 為有趨勢。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表2 實時定量PCR 引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 新生仔豬的體重

從表3可以看出，與NBW 新生仔豬相比，LBW新生仔體重顯著降低（P＜0.05）。

表3 新生仔豬的體重Table 3 Body weight of neonatal piglets

2.2 低出生重對新生仔豬肝臟抗氧化能力的影響

從表4可以看出，與NBW 新生仔豬相比，LBW新生仔豬 T-SOD 和 GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），AHR 活性有降低的趨勢（P=0.08）。

表4 低出生重對新生仔豬肝臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of LBW on the antioxidant activity in liver of neonatal piglets

2.3 低出生重對哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

從表5可以看出，與NBW 哺乳仔豬相比，LBW哺乳仔豬肝臟 ASA 和 AHR 活性顯著降低（P＜0.05）；與LBW 哺乳仔豬相比，飼糧添加1.0%Arg 顯著提高 LBW 哺乳仔豬肝臟 AHR、T-SOD 和 GSH-Px 活性（P＜0.05）。

2.4 低出生重對哺乳仔豬肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

從表6可以看出，與NBW 哺乳仔豬相比，LBW哺乳仔豬肝臟Nrf2 和NQO-1 表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）；與LBW 哺乳仔豬相比，飼糧添加1.0%Arg顯著降低 LBW 哺乳仔豬肝臟 NQO-1 表達(dá)量（P＜0.05）。

表5 低出生重對哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)Table 5 Effects of LBW on the antioxidant activity in liver of suckling piglets and the nutritional regulation by L-arginine

表6 低出生重對哺乳仔豬肝臟抗氧化相關(guān)基因的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)Table 6 Effects of LBW on the expression of antioxidant genes in liver of suckling piglets and the nutritional regulation by L-arginine

2.5 低出生重對哺乳仔豬肝臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

從表7可以看出，與NBW 哺乳仔豬相比，LBW哺乳仔豬肝臟 IL-1β（P=0.09）和 IL-6（P=0.06）表達(dá)量有提高的趨勢；與LBW 哺乳仔豬相比相比，飼糧添加1.0%Arg 顯著降低LBW 哺乳仔豬肝臟IL-1β和 IL-6 表達(dá)量（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 低出生重對新生仔豬肝臟抗氧化功能的影響

自由基產(chǎn)生于機體代謝，過多的自由基會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA 損傷[24]。ASA 和AHR 活性分別代表超氧陰離子和羥自由基的清除能力[25]。線粒體電子傳遞過程產(chǎn)生的自由基是機體自由基的主要來源，肝臟富含線粒體，是自由基攻擊的主要器官[26-27]。在生理條件下，機體抗氧化系統(tǒng)可清除自由基，維持氧化還原平衡。前人運用蛋白組學(xué)研究表明，與NBW 新生仔豬相比，IUGR 新生仔豬肝臟抗氧化相關(guān)蛋白含量顯著降低[9]。有研究結(jié)果表明，與NBW 新生仔豬相比，IUGR 新生仔豬肝臟抗氧化酶T-SOD、GPx 和CAT 活性顯著降低[10]。本研究結(jié)果表明，與 NBW 相比，LBW 新生仔豬肝臟T-SOD 和 GSH-Px 活性顯著降低，AHR 活性有降低的趨勢，本研究結(jié)果與前人一致，說明LBW新生仔豬肝臟抗氧化能力降低。

表7 低出生重對哺乳仔豬肝臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)Table 7 Effects of LBW on the expression of cytokine genes in liver of suckling piglets and the nutritional regulation by L-arginine

3.2 低出生重對哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

隨著日齡的增加，LBW 仔豬肝臟抗氧化能力可能仍然低于NBW 仔豬。前人研究結(jié)果表明[28]，與NBW 哺乳仔豬相比，IUGR 哺乳仔豬7日齡時肝臟總抗氧化活性和CAT 活性顯著降低，23日齡時肝臟總抗氧化活性和SOD 活性顯著降低。有研究結(jié)果表明，與NBW 哺乳仔豬相比，IUGR 哺乳仔豬28日齡時肝臟GPx 活力顯著降低[11，29]。本研究結(jié)果表明，4日齡開始，飼喂 21 d 后，與 NBW 仔豬相比，LBW仔豬ASA 和AHR 活性顯著降低，本研究結(jié)果與前人一致，說明LBW 哺乳仔豬肝臟抗氧化能力降低。我們前期研究表明[30]，4日齡開始，人工乳飼喂21 d后，與NBW 仔豬哺乳相比，LBW 哺乳仔豬末重、平均日增重、平均日采食量和料重比顯著降低，而飼糧添加1.0%Arg 顯著提高LBW 哺乳仔豬末重、平均日增重和平均日采食量，有提高其料重比的趨勢，說明LBW 哺乳仔豬生長性能降低，補充1.0%Arg 可改善其生長性能。Arg 有改善仔豬抗氧化功能的作用。前人研究表明，Arg 添加提高氧化應(yīng)激仔豬血清總抗氧化活性、GPx 活性和 SOD 活性[18]。前人研究表明，添加0.8%的Arg 顯著提高了血清CAT、SOD 和 GPx 的活性，提高仔豬抗氧化能力[31]。本研究結(jié)果表明，與LBW 組仔豬相比，飼糧添加1.0%Arg 顯著提高LBW 哺乳仔豬肝臟T-SOD、GSH-Px和AHR 活性，本研究結(jié)果與前人一致，說明補充1.0%Arg 改善了LBW 哺乳仔豬肝臟抗氧化功能。

Nrf2 是機體發(fā)揮抗氧化作用重要的轉(zhuǎn)錄因子，氧自由基的大量產(chǎn)生使Nrf2 活化，活化的Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 啟動子區(qū)域的抗氧化元件結(jié)合，激活下游的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)節(jié)NQO1、HO-1、SOD 等基因的轉(zhuǎn)錄，可抵抗自由基造成的危害[32-33]。NQO-1 在細(xì)胞內(nèi)屬于高度可誘導(dǎo)的還原酶，主要受Nrf2 信號途徑的調(diào)節(jié)，它以NADH 或NADPH 為電子供體，催化醌類化合物發(fā)生還原反應(yīng)，從而阻止它們進(jìn)一步參與氧化還原反應(yīng)和氧自由基的產(chǎn)生[34]。仔豬受到應(yīng)激后，啟動自身的保護(hù)性反應(yīng)，顯著提高肝臟Nrf2 蛋白表達(dá)量[35]。本研究結(jié)果表明，與NBW 哺乳仔豬相比，LBW 哺乳仔豬肝臟Nrf2 和NQO-1 表達(dá)量顯著提高，與LBW 哺乳仔豬相比，飼糧添加1.0%Arg 顯著降低LBW 哺乳仔豬肝臟NQO-1 表達(dá)量，說明LBW 哺乳仔豬啟動了自身的保護(hù)性反應(yīng)，激活了肝臟Nrf2 途徑，補充1.0%Arg 可能緩解了此途徑的激活，改善LBW 哺乳仔豬肝臟抗氧化功能。

3.3 低出生重對哺乳仔豬肝臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營養(yǎng)效應(yīng)

細(xì)胞因子主要是由免疫細(xì)胞（如單核、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，其中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 屬于炎性細(xì)胞因子，可引發(fā)炎癥，IL-10 屬于抗炎細(xì)胞因子，可抵抗炎癥。Zheng P.等研究表明，與NBW 仔豬相比，IUGR 仔豬肝臟 IL-1β 和 TNF-α 含量顯著提高，IL-10 含量顯著降低導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥[28]，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)相似，與NBW 組相比，LBW 組哺乳仔豬肝臟IL-1β 和IL-6 表達(dá)量有提高的趨勢，說明LBW 哺乳仔豬肝臟可能發(fā)生了炎癥。飼糧添加Arg可調(diào)節(jié)仔豬細(xì)胞因子表達(dá)。Li Q.等研究結(jié)果表明，飼糧添加Arg 可通過TLR4-NF-ΚB 信號途徑降低仔豬肝臟促炎因子的分泌，緩解大腸桿菌誘導(dǎo)的肝臟損傷[36]。本研究結(jié)果表明，與LBW 組仔豬相比，飼糧添加1.0%Arg 顯著降低LBW 哺乳仔豬肝臟IL-1β和IL-6 表達(dá)量，該結(jié)果與前人一致，說明補充1.0%Arg降低LBW 仔豬肝臟炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，有保護(hù)肝臟的作用。

綜上，在本試驗條件下，LBW 仔豬肝臟抗氧化能力低于NBW 仔豬，補充1.0% Arg 可改善LBW哺乳仔豬肝臟抗氧化功能。