一種富含氨基酸的功能性肽鹽的工藝研究

秦 鵬，王淑慧，趙金龍，孫漢巨，王軍輝，何述棟，張 強(qiáng)

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽復(fù)合調(diào)味品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽強(qiáng)旺調(diào)味食品有限公司，安徽 界首 236500）

豆粕是大豆經(jīng)過壓榨豆油后得到的一種副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量為40%～48%，并含有碳水化合物、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)元素、黃酮等多種營(yíng)養(yǎng)及功能成分[1]。我國(guó)是豆粕生產(chǎn)大國(guó)，然而每年大約85%的豆粕被用于家禽、家畜的飼養(yǎng)，僅有少許被用于其他行業(yè)[2]。因此，開發(fā)以豆粕為原料的新產(chǎn)品，對(duì)于擴(kuò)展資源的利用和應(yīng)用范圍，具有重要意義。

近年來，隨著酶工程技術(shù)的迅猛應(yīng)用，通過酶解豆粕中的大豆蛋白，制備功能性大豆多肽和氨基酸的工藝已取得長(zhǎng)足的發(fā)展[3]。大豆多肽是大豆蛋白在一定的條件下，被酶解再經(jīng)過分離純化后，得到的一種由多種多肽和游離氨基酸組成的混合物。研究發(fā)現(xiàn)，大豆多肽具有一些獨(dú)特的功能，如抗菌性、抗過敏性、抗氧化性等，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低膽固醇含量、防病治病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等作用[4-5]。Shu-Tzu Chen等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，大豆多肽能使血清的膽固醇含量降低24%以上，可有效預(yù)防和改善因膽固醇含量超標(biāo)而造成的各種疾病，且無副作用。通過美拉德反應(yīng)制備的美拉德肽進(jìn)而與食鹽進(jìn)行調(diào)配，制成美拉德肽鹽，既可以充分利用大豆多肽提高其附加值，又可以開發(fā)新型的調(diào)味鹽，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。

目前，市場(chǎng)存在加碘鹽、加鋅鹽、加鐵鹽、加鈣鹽、低鈉鹽等具有單一營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充功能或單一保健功能的食鹽，調(diào)味鹽的品種較為單一。研究開發(fā)的富含氨基酸的功能性肽鹽不僅具有氨基酸補(bǔ)充功能，且具有美拉德肽獨(dú)特的香味，經(jīng)過超微粉碎處理后，該產(chǎn)品具有了低鈉鹽的特性，豐富了功能性食鹽的種類，同時(shí)也為低鈉鹽的產(chǎn)業(yè)化提供了新思路。試驗(yàn)選用豆粕為原料，與木糖、半胱氨酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備獨(dú)特風(fēng)味的美拉德產(chǎn)物，以感官評(píng)價(jià)中的口感、氣味及顏色為主要考核指標(biāo)，研究檸檬粉、葛根粉、甘氨酸鋅等物質(zhì)的添加量對(duì)最終氨基酸肽鹽感官品質(zhì)的影響，從而開發(fā)出口味獨(dú)特、富含必需氨基酸的保健型調(diào)味鹽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕，市售；葛根、決明子、甘草、檸檬，均購(gòu)于合肥市家樂福超市；L-鹽酸賴氨酸、L-蛋氨酸、色氨酸、甘氨酸鋅、?；撬幔戏什┟郎锟萍加邢薰咎峁?；堿性蛋白酶、中性蛋白酶（酶活力20萬 U/g，6萬 U/g），北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供；木瓜蛋白酶（酶活力2萬 U/g），北京索萊寶生物科技有限公司提供；風(fēng)味蛋白酶（酶活力2萬 U/g），丹麥諾維信酶制劑公司提供；D-木糖、L-半胱氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；鹽酸（AR），上海中試化工總公司提供；碳酸鈉（AR），江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供；食鹽、D-異抗壞血酸鈉，均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140型電子分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TGL16M型高速冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型精密pH計(jì)，上海今邁儀器儀表有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HX-300型高速中藥粉碎機(jī)，浙江永康溪岸五金藥具廠產(chǎn)品；XDW型振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司產(chǎn)品；NR200型手持式色差計(jì)，深圳3NH科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氨基酸肽鹽制備工藝流程

①豆粕粉碎→懸浮液→酶水解→滅活→抽濾→旋蒸→冷凍干燥→油浴→冷凍干燥；

②檸檬→清洗→去皮→切片→滅酶→護(hù)色→干燥→磨粉→過篩→超微粉；

③食鹽、L-鹽酸賴氨酸、L-蛋氨酸、色氨酸、甘氨酸鋅、?；撬幔?/p>

④葛根、決明子、甘草→干燥→粉碎→過篩→超微粉碎；

①+②+③+④→調(diào)配→超微粉碎→成品。

1.3.2 美拉德肽的制備

采用粉碎機(jī)將豆粕粉碎，過80目篩備用。取適量的豆粕粉，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的豆粕懸浮液，于80℃條件下預(yù)熱處理30 min，冷卻至室溫后，豆粕懸浮液用濃度為6 mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10，添加5 000 U/g堿性蛋白酶，于50℃條件下保溫3 h；之后，調(diào)節(jié)豆粕懸浮液pH值至6.5，同時(shí)添加木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶至溶液酶活力分別達(dá)到5 500，5 000，8 000 U/g，并于55℃條件下保溫4 h；將酶解液在90℃下加熱15 min，冷卻至室溫后抽濾，將濾液濃縮后，冷凍干燥，收集大豆多肽備用。將大豆多肽、半胱氨酸、D-木糖按質(zhì)量比5∶1∶2配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的溶液，用濃度6 mol/L碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，再置于120℃油鍋中處理120 min，冷卻至室溫后，冷凍干燥，之后收集產(chǎn)物備用[7]。

1.3.3 檸檬粉的制備

將新鮮的檸檬清洗后切片，厚度約為0.5 cm，去果核，置于100℃水中浸泡5 min后，立即浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的抗壞血酸溶液中，在55℃條件下水浴5 min，防止檸檬顏色發(fā)生改變[8]。將浸泡后的檸檬片經(jīng)干燥后粉碎，過80目篩，之后經(jīng)超微粉碎機(jī)再次粉碎，收集粉末備用。

1.3.4 葛根粉、甘草粉的制備

將葛根、甘草、決明子清洗，經(jīng)烘干、粉粹后過80目篩，用超微粉碎機(jī)再次粉碎，收集粉末備用。

1.3.5 感官評(píng)定

由8位評(píng)定員隨機(jī)對(duì)調(diào)味鹽的口感、氣味及顏色進(jìn)行評(píng)定[4]，采用10分制。

調(diào)味鹽的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.6 輔料的用量對(duì)調(diào)味鹽的感官影響

（1） 氨基酸的用量對(duì)調(diào)味鹽的感官影響。調(diào)味鹽中食鹽用量9.0 g，美拉德肽用量0.5 g，L-蛋氨酸、?；撬?、色氨酸、L-鹽酸賴氨酸和甘氨酸鋅的用量分別為 0， 0.002， 0.004，0.006， 0.008 g， 加水定容至1 000 mL，固定其中4種氨基酸用量，依次改變另一種氨基酸用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，分別確定5種氨基酸用量。

（2） 美拉德肽、甘草粉、決明子、檸檬粉和葛根粉用量對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)的影響。調(diào)味鹽中食鹽用量9.0 g，L-蛋氨酸、?；撬帷⑸彼?、L-鹽酸賴氨酸以及甘氨酸鋅用量均為0.005 g，美拉德肽、甘草粉、決明子、檸檬粉和葛根粉用量均分別為0，0.1，0.2， 0.3，0.4 g，加水定容至1 000 mL，固定其中4種物質(zhì)的用量，依次改變另一種物質(zhì)的用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，分別確定美拉德肽、甘草粉、決明子、檸檬粉和葛根粉的用量。

表1 調(diào)味鹽的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（3） 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽穩(wěn)定性的影響。將食鹽、美拉德肽、甘草粉、決明子、檸檬粉和葛根粉及5種氨基酸按所得比例混合，經(jīng)超微粉粹，粉粹時(shí)間分別為3，6，9，12 min，以感官評(píng)分、色度、粒度及DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定最佳超微粉碎時(shí)間[9]。

（4） 調(diào)味鹽粒度的測(cè)定。取適量超微粉碎后的樣品，分別用無水乙醇進(jìn)行分散，將分散后的粉體混懸液加入到激光粒度分析儀的測(cè)定杯中，按操作說明進(jìn)行測(cè)定。

（5） 調(diào)味鹽色度的測(cè)定。取適量上述樣品，采用色差計(jì)進(jìn)行色度檢測(cè)，確定每個(gè)時(shí)間下的產(chǎn)品色度數(shù)據(jù)，并做好記錄。色差儀中L，a，b值分別表示黑白、紅綠及黃藍(lán)，所有的顏色都可以通過L，a，b值色空間感知并測(cè)量，這些數(shù)據(jù)也可以用來表示標(biāo)樣同測(cè)試樣的色差，并通常用ΔL，Δa，Δb值表示[10]。該試驗(yàn)中使用的對(duì)照樣為標(biāo)準(zhǔn)白色平板。

（6） 調(diào)味鹽DPPH自由基清除能力的測(cè)定。樣品DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考嚴(yán)敏等人[11]的方法：稱取一定量的DPPH固體溶解于無水乙醇中，配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL DPPH溶液；用超純水配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL氨基酸肽鹽溶液。取2 mL該溶液，加入等體積的DPPH溶液，混合均勻，于室溫下避光放置30 min后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min。取上清液于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度；取2 mL無水乙醇與等體積DPPH溶液混勻后，在相同條件下測(cè)吸光度；取2 mL無水乙醇和等體積樣品溶液混合后在相同條件下測(cè)吸光度。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用以下公式計(jì)算：

式中：A0——2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度；

A1——2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；

A2——2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸用量對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)的影響

氨基酸用量對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 氨基酸用量對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)的影響

為了賦予調(diào)味鹽具有氨基酸的保健功能，故在調(diào)味鹽中添加不同種類的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑型氨基酸。由圖1可知，隨著氨基酸用量的增加，產(chǎn)品的感官品質(zhì)并無明顯的升高或降低的趨勢(shì)，可認(rèn)為不同種類的氨基酸的添加對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)沒有影響。分析產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因如下：第一，營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑型氨基酸自身無味道且水溶性良好，并不會(huì)對(duì)產(chǎn)品在口感及顏色方面產(chǎn)生影響；第二，營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑氨基酸的用量較少，最多占產(chǎn)品的1‰，因此并不會(huì)影響調(diào)味鹽產(chǎn)品感官品質(zhì)，同時(shí)賦予了調(diào)味鹽氨基酸的保健功能。

2.2 美拉德肽、甘草粉、決明子、檸檬粉和葛根粉用量的對(duì)調(diào)味鹽感官品質(zhì)的影響

美拉德肽、甘草、決明子、檸檬和葛根用量對(duì)鹽感官品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 美拉德肽、甘草、決明子、檸檬和葛根用量對(duì)鹽感官品質(zhì)的影響

由圖2可知，5種輔料用量對(duì)調(diào)味鹽的感官評(píng)分呈現(xiàn)出不同程度的影響。其中，隨著美拉德肽用量的增加，感官品質(zhì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)用量大于0.2 g時(shí)，產(chǎn)品的感官評(píng)分逐漸減小。這可能因?yàn)橐欢康拿览码哪軌蛸x予產(chǎn)品獨(dú)特的香味，但隨著美拉德肽用量的增加，產(chǎn)生的香味過于濃郁，掩蓋了其他輔料的味道，破壞了整體風(fēng)味的和諧，且造成產(chǎn)品色澤較為暗淡而令品嘗人員逐漸難以接受；而隨著甘草和決明子用量的增加，感官品質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在二者用量為零時(shí)，調(diào)味鹽具有最高感官評(píng)分?？赡苡捎诟什葜杏欣w維性沉淀而決明子粉會(huì)產(chǎn)生褐色不溶性沉淀，極大地影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)；隨著葛根用量的增加，感官品質(zhì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)其用量大于0.1 g時(shí)，感官品質(zhì)逐漸減小[12]。這可能是隨著用量的逐漸增加，溶液顏色變暗，嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的色澤；隨著檸檬用量的增加，產(chǎn)品的感官品質(zhì)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)；當(dāng)用量為0.4 g時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值（8.33分）。這可能是由于檸檬的添加會(huì)賦予產(chǎn)品清爽的口感，而隨著檸檬用量的增加，清爽的口感逐漸增強(qiáng)。綜上所述，確定調(diào)味鹽產(chǎn)品的調(diào)配比例為美拉德肽用量0.2 g，檸檬用量0.4 g，葛根用量0.1 g，而甘草與決明子不添加。

2.3 調(diào)味鹽調(diào)配的正交試驗(yàn)

調(diào)味鹽配方的正交試驗(yàn)見表2。

表2 調(diào)味鹽配方的正交試驗(yàn)

由表2可知，A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，B次之，C和D對(duì)產(chǎn)品感官分?jǐn)?shù)的影響最小。正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果為A1B1C2D1，而極差分析的最優(yōu)結(jié)果為A1B1C1D1，由于A，B及D的最優(yōu)水平相同，因此需要通過試驗(yàn)來驗(yàn)證[13]。

驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜上所述，正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)配方為A1B1C2D1，故而最終調(diào)味鹽的最優(yōu)配方為氯化鈉用量9.0 g，美拉德肽用量0.15 g，檸檬粉用量0.3 g，葛根粉用量0.1 g，L-鹽酸賴氨酸用量0.006 g，甘氨酸鋅、色氨酸、L-蛋氨酸及?；撬嵊昧烤鶠?.005 g。

2.4 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽粒度的影響

超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽粒度的影響見表4。

表4 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽粒度的影響

由表4可知，隨著超微粉碎時(shí)間的增加，調(diào)味鹽產(chǎn)品的 D10， D50， D90， D（ 4，3）， D（ 3，2）及比表面積均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。這表明，肽鹽產(chǎn)品粒徑隨著超微粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，而產(chǎn)品的感官品質(zhì)隨著超微粉碎時(shí)間逐漸增高。當(dāng)超微粉碎12 min時(shí)，產(chǎn)品的粒度最小，感官品質(zhì)最高（8.33分）。這可能是由于超微粉碎的作用，造成肽鹽產(chǎn)品中各原料粒徑減小，比表面積增大，從而使呈味物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分溶出更加充分，入味效果也得到很大改善。另一方面，由于美拉德肽鹽中咸味的產(chǎn)生主要來自于氯化鈉離子的貢獻(xiàn)，且其離子半徑越小，咸味越純正[14]。由此推斷產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因是：隨著超微粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，固體中氯化鈉粒子的中位徑減小，即固體中氯離子和鈉離子的聚合程度降低，而在溶于水時(shí)其水解電離過程更加容易，分散程度更高。因此，咸味也更加純正。

2.5 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽色差的影響

超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽色差的影響見圖3。

圖3 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽色差的影響

由圖3可看出，ΔL，Δa，Δb值均為正值，即超微粉碎后的產(chǎn)品與原樣品相比亮度及色度值均出現(xiàn)明顯提高。通過對(duì)比不同曲線及其趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，隨著超微粉碎時(shí)間的增加，產(chǎn)品顏色越來越白，表明超微粉碎能有效改善肽鹽產(chǎn)品的色度，提升其感官品質(zhì)。隨著超微粉碎時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，ΔL值降低，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品粒徑逐漸降低，其折光能力越差被顆粒反射的光就會(huì)減少。因此，ΔL值將會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而隨著超微粉碎時(shí)間的增加，Δa，Δb值并沒有明顯的變化。

2.6 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽DPPH自由基清除能力的影響

超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽DPPH自由基清除率的影響見圖4。

圖4 超微粉碎時(shí)間對(duì)調(diào)味鹽DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基清除能力是抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，對(duì)于衡量產(chǎn)品的耐貯藏性具有重要意義。由圖4可知，超微粉碎時(shí)間從0 min延長(zhǎng)至9 min[15]，產(chǎn)品DPPH自由基清除能力隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢(shì)。這可能是由于超微粉碎使肽鹽產(chǎn)品各原料粒徑減小、比表面積增大，致使肽鹽產(chǎn)品原料，如美拉德肽、檸檬粉及葛根粉中一些抗氧化成分（多肽、維C和黃酮類物質(zhì)）的更加充分的溶出，從而使其DPPH自由基清除率顯著提高。而超微粉碎9 min以后，產(chǎn)品DPPH自由基清除能力隨超微粉碎時(shí)間增長(zhǎng)而略有下降，這可能是由于進(jìn)一步隨著超微粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品中的抗氧化性物質(zhì)被逐漸破壞，從而使產(chǎn)品的還原性下降。綜合粒度、感官評(píng)分、色差及DPPH自由基清除率結(jié)果，超微粉碎時(shí)間為9 min時(shí)該調(diào)味鹽具最好的感官接受度、炫白的色澤及較高的抗氧化活性。

3 產(chǎn)品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

3.1 感官指標(biāo)

色澤：白色略帶微黃色。

風(fēng)味：具有良好的美拉德風(fēng)味，無令人不愉快的異味。

組織狀態(tài)：無肉眼可見的外來異物，無結(jié)塊。

3.2 理化指標(biāo)

氯化鈉含量＞60%，其他輔料可以按需求添加，水分含量≤0.8%。

3.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤10CFU/mL，大腸菌群≤10CFU/100mL，致病菌不得檢出。

3.4 其他

其他各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)要求，均符合國(guó)家有關(guān)質(zhì)量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了調(diào)味鹽的最佳配料比，即氯化鈉用量9 g，美拉德肽用量0.15 g，檸檬粉用量0.3 g，葛根粉用量0.1 g，L-鹽酸賴氨酸用量0.006 g，甘氨酸鋅、L-蛋氨酸、色氨酸、?；撬峋鶠?.005 g，從而制備出具有氨基酸補(bǔ)充功能的調(diào)味肽鹽。在通過超微粉碎對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行粉碎，綜合最終產(chǎn)品的感官評(píng)分、粒度、色差及DPPH自由基清除率的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超微粉碎為9 min時(shí)，該調(diào)味鹽具有較高的分散度（D50達(dá) 到14.83μm）、最好的感官接受度（感官評(píng)分達(dá)到8.33分）、白凈的顏色及最高的抗氧化性（達(dá)到80.89%），這為增加食鹽產(chǎn)品種類及實(shí)現(xiàn)低鈉生活提供了可能。