叢枝菌根真菌對杜鵑花耐熱性的影響

王穎穎，趙 冰，李 瑩

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌712100）

杜鵑花Rhododendron是舉世公認(rèn)的名貴觀賞花卉，被譽為 “世界之花” “花木之王”，也是國內(nèi)的“十大名花”之一［1］。杜鵑花喜陰涼、潮濕環(huán)境，高溫是限制杜鵑花正常生長和廣泛利用的關(guān)鍵性因子，因此開展杜鵑花耐熱等抗逆研究顯得尤為重要［2-5］。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要成員［6］，是一種能與90%以上的植物形成共生關(guān)系的微生物［7］。有研究表明：接種AMF可以顯著促進(jìn)植物的生長［8-9］，提高植物抗連作障礙的能力［10］，并能在一定程度上降低逆境脅迫，增強植物的抗逆性［11-14］。但接種AMF對杜鵑花抗熱性影響的研究還未見報道。本研究對杜鵑花苗接種AMF，測定杜鵑花葉片的各項生理指標(biāo)參數(shù)和解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)，以探討在高溫脅迫下，AMF對杜鵑花苗耐熱性的影響，為杜鵑花在華北地區(qū)園林綠化中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物 選取生長健壯、長勢一致的杜鵑花品種 ‘筆止’Rhododendron‘Bi Zhi’扦插苗12盆，1株·盆-1。均栽培于陜西省楊凌新天地示范園。

1.1.2 供試菌劑 3種供試叢枝菌根真菌：根內(nèi)球囊霉Glimus intraradices（Gi），摩西球囊霉Glomus mosseae（Gm）和幼套球囊霉Glomus etunicatum（Ge）均由甘肅渤豐農(nóng)林牧科技有限公司提供。將根內(nèi)球囊霉、摩西球囊霉和幼套球囊霉的孢子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為30%過氧化氫消毒10 min，用無菌水漂洗數(shù)次，接種于三葉草Trifolium repens和苜蓿Medicago sativa，富集培養(yǎng)2個月后，去除地上部分，將孢子、菌根和根外菌絲制成AMF接種劑，孢子密度為70個·g-1。

1.1.3 供試基質(zhì) 試驗土壤pH值6.0，主要原料為優(yōu)質(zhì)草炭、進(jìn)口基質(zhì)原料、珍珠巖、蛭石等。購于楊凌鑫方實驗材料供應(yīng)站。于烘箱中160℃高溫滅菌2 h，自然冷卻后繼續(xù)160℃高溫滅菌2 h后晾干備用。

1.2 實驗設(shè)計

試驗于2017年1月至2018年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院實驗室內(nèi)進(jìn)行。接種前，用質(zhì)量濃度為5%的高錳酸鉀溶液對所用花盆進(jìn)行消毒。試驗設(shè)4個處理：接種根內(nèi)球囊霉（Gi），接種摩西球囊霉（Gm），接種幼套球囊霉（Ge）和不接種AMF的對照組（ck）。接種處理采用層施法，施接種菌劑80 g·盆-1。每處理重復(fù)3次。

接種后將杜鵑花苗放回楊凌新天地日光溫室，溫度為（25±1）℃，期間所有處理正常供水。接種50 d后將杜鵑花苗搬入（BIC-400）人工氣候箱中進(jìn)行預(yù)處理（25℃），光照時間為14 h/10 h（光照/黑暗），光照度12 000 lx，相對濕度80%，處理3 d。之后，將人工氣候箱溫度調(diào)為35℃/25℃（白天/晚上），光強和空氣濕度不變， 澆水1次·d-1，保持水分充足，高溫脅迫處理10 d。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 叢枝菌根真菌侵染率測定 采集處理的杜鵑花幼苗的須根系，洗凈，切成1～2 cm小段，浸入V（甲醛）∶V（冰醋酸）∶V（體積分?jǐn)?shù)為 50%乙醇）=13∶5∶200的固定液中， 浸泡 4 h， 再浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8%氫氧化鉀溶液，90℃水浴30 min，取出根段后洗凈，于體積分?jǐn)?shù)為5%乳酸溶液中浸泡5 min。用酸性品紅溶液染色，最后在顯微鏡下觀察杜鵑花根部是否被侵染，并計算AMF侵染率=（侵染根段長/觀察根段長）×100%。

1.3.2 生理指標(biāo)測定 在高溫處理0，5，10 d時，取各植株相同生長部位成熟的葉片采樣，每次0.1 g，各重復(fù)3次?？扇苄蕴遣捎幂焱y定，游離脯氨酸、丙二醛、細(xì)胞膜透性、葉綠素等指標(biāo)的測定均采用路文靜等［15］描述的方法。利用總蛋白質(zhì)測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A045）考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)測定 生理指標(biāo)測定結(jié)束后，將試驗植株常溫處理10 d。之后將不同處理植株分為常溫對照組（25℃/18℃）和高溫試驗組（35℃/25℃），放入人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。處理結(jié)束后于早上10：00采集健康植株葉片，迅速切成3 mm×3 mm，投入體積分?jǐn)?shù)為4%戊二醛溶液中常溫固定6 h，磷酸緩沖液 （0.1 mol·L-1，pH 6.8）漂洗4次。用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，80%，90%乙醇依次脫水，100%乙醇脫水3次，乙酸異戊酯置換后，用二氧化碳臨界點干燥儀（K-850），離子濺射儀（E-1045）噴金，再用鎢燈絲掃描電鏡（JSM-6360LV）對樣本進(jìn)行觀察。隨機選取10個視野對葉肉橫切片觀察、拍照。最后用Nano Measure 1.2測量軟件測量葉片厚度、柵欄組織及海綿組織厚度，并計算柵欄海綿組織比、組織結(jié)構(gòu)疏松度和組織結(jié)構(gòu)緊密度。柵欄海綿組織比=（柵欄組織厚度/海綿組織厚度）×100%；組織結(jié)構(gòu)緊密度=（柵欄組織厚度/葉片厚度）×100%；組織結(jié)構(gòu)疏松度=（海綿組織厚度/葉片厚度）×100%。

1.4 耐熱性綜合評價

耐熱性綜合評價采用隸屬函數(shù)值對各項指標(biāo)進(jìn)行評價，與耐熱性正相關(guān)采用公式B（xi）=（xi-xmin）/（xmax-xmin）； 負(fù)相關(guān)采用公式B（xi）=1-（xi-xmin）/（xmax-xmin）。 其中：B（xi）為耐熱隸屬函數(shù)值；xi為指標(biāo)測定值；xmin為測定指標(biāo)最小值，xmax為測定指標(biāo)最大值。根據(jù)上述公式，計算出杜鵑花品種 ‘筆止’各生理指標(biāo)平均隸屬函數(shù)值，然后進(jìn)行排序，隸屬函數(shù)值越大，耐熱性越強［16］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AMF對杜鵑花根系的侵染率

由圖1可知：常溫條件下3種AMF對杜鵑花根系的根侵染率不同。其中Gi侵染率最高，為49.6%，而Ge（37.4%）侵染率較低。

2.2 高溫脅迫下，不同AMF對杜鵑花葉片生理指標(biāo)的影響

2.2.1 不同AMF對高溫下杜鵑花葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表1可見，常溫下接種AMF對杜鵑花葉片的可溶性糖的影響不顯著，隨著溫度的增加，試驗組和對照組的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所增加。脅迫5 d，接種Gi和Gm的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組（P＜0.05），脅迫10 d，接種Gi的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高最為顯著。

圖1 不同AMF對杜鵑花根系的侵染率Figure 1 Colonization percentage of different arbuscular mycorrhizal fungi on Rhododendron roots

2.2.2 不同AMF對高溫下杜鵑花葉片可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響 由表1可見：常溫下接種AMF對可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響不大，脅迫5 d，接種Gi，Gm，Ge和ck分別比常溫下增加了20.3%，92.9%，39.8%，37.3%，其中接種Gm最為顯著。隨著脅迫天數(shù)增加，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度呈遞減趨勢，造成這一情況的原因可能是持續(xù)高溫導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)合成所需的酶喪失活性，進(jìn)而阻礙了可溶性蛋白質(zhì)的合成。高溫脅迫10 d，接種Ge的效果最好，比ck增加了40.3%。在高溫脅迫5 d和10 d，Gm和Ge分別表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢。

2.2.3 不同AMF對高溫下杜鵑花葉片脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表1可見：隨著脅迫天數(shù)的增加，脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨之增加。高溫脅迫5 d，接種Gi，Gm和Ge的葉片脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比ck增加了7.4%，32.2%，47.6%，高溫脅迫10 d，接種Gm表現(xiàn)最優(yōu)，比ck增加了19.5%。

2.2.4 不同AMF對杜鵑花葉片細(xì)胞膜透性、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響 由表1可見：隨著脅迫天數(shù)的增加，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞膜透性增加。高溫下接種AMF有效降低了細(xì)胞膜透性。高溫脅迫5 d，接種Ge葉片細(xì)胞膜透性比ck降低了12.9%，高溫脅迫10 d，接種Gi，Gm，Ge的杜鵑花葉片比ck各降低了5.8%，4.5%，8.3%。丙二醛是膜脂過氧化產(chǎn)物，它可以與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和酶等結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性遭到破壞，喪失選擇透性，引起電導(dǎo)率的上升。高溫脅迫下，杜鵑花葉片的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，對植物造成一定的傷害，接種AMF有限緩解了丙二醛的積累。其中接種Gi，Gm最為明顯，5 d時，比ck減少了44.9%，39.0%。10 d，比ck減少了56.1%，26.4%。

2.2.5 不同AMF對高溫下杜鵑花葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 隨著溫度的升高和脅迫時間的增加，接種AMF和對照組杜鵑花的葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低（圖2）。高溫脅迫10 d，葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，而接種AMF的杜鵑花葉片葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于ck。接種Gi的杜鵑花葉片的葉綠素a、葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別比ck增加了39.7%，33.0%，16.3%，接種Gm的杜鵑花葉片的葉綠素b效果最為顯著，比ck增加了33.3%，Gi次之。

表1 不同AMF對杜鵑花葉片生理參數(shù)的影響Table 1 Effects of different arbuscular mycorrhizal fungi on physiological parameters of azaleas leaves

圖2 不同AMF對杜鵑花葉片葉綠素、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 2 Effects of different arbuscular mycorrhizal fungi on chlorophyll and carotenoids content in leaf of Rhododendron

2.3 不同AMF對杜鵑花葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

從圖3可以看出：葉片解剖結(jié)構(gòu)由葉表皮、柵欄組織、海綿組織及葉脈組成。葉表皮包括上表皮和下表皮，上、下表皮均為單層細(xì)胞且呈不規(guī)則扁長方形，排列緊密，表皮無毛。柵欄組織排列較為緊密，呈長柱形，海綿組織位于柵欄組織和葉片下表皮之間，且排列較為疏松。常溫條件下，試驗組柵欄組織排列較整齊，且呈長柱，ck柵欄組織整齊度變差。在高溫下，ck和試驗組柵欄組織和海綿組織厚度呈減小趨勢，接種AMF的杜鵑花葉片解剖結(jié)構(gòu)的部分柵欄組織細(xì)胞變短變粗，ck柵欄組織大部分發(fā)生短縮，排列參差不齊且海綿組織細(xì)胞排列零散，細(xì)胞間隙大。

圖3 杜鵑花葉片解剖結(jié)構(gòu)Figure 3 Foliar anatomical structures of Rhododendron

由表2可知：接種不同AMF并不同溫度處理的杜鵑花葉片的葉肉細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)差異顯著（P＜0.05）。常溫條件下葉片平均厚度為186.49～201.75 μm，高溫條件下葉片平均厚度126.41～187.49 μm，其中高溫下ck葉片最薄（126.41 μm），常溫下接種Gi菌的杜鵑花葉片最厚，為201.75 μm。海綿組織排列較為疏松，厚度均大于柵欄組織厚度，因此柵欄海綿組織比（簡稱柵欄比）均小于1。在高溫條件下，接種AMF的杜鵑花葉片的柵欄比顯著高于對照組（P＜0.05），而細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)疏松度小于對照組。常溫條件下，對照組和實驗組表現(xiàn)不明顯。

表2 不同AMF對杜鵑花葉片葉肉組織結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of different arbuscular mycorrhizal fungi on mesophyll structure of Rhododendron

2.4 不同AMF耐熱性綜合評價

對以上生理指標(biāo)（可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、丙二醛、細(xì)胞膜透性、葉綠素）進(jìn)行隸屬函數(shù)分析（表3）。根據(jù)平均隸屬度排序，最終表明高溫下，接種Gi效果最明顯，其次是Gm，接種Ge的效果最差。

3 討論

叢枝菌根真菌（AMF）是土壤微生物群落中生物量最大、最重要的成員之一，廣泛分布于各種土壤生境中，對保持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用［17］。大量研究表明：AMF能與植物根系形成共生菌根，有提高植物抗高溫能力［18］。本試驗也證明了接種叢枝菌根真菌可提高了杜鵑花 ‘筆止’的耐熱性，表現(xiàn)為杜鵑花葉片組織結(jié)構(gòu)受損較輕，葉片厚度、柵欄比、細(xì)胞結(jié)構(gòu)密度均有所提高；可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增加；此外，接種AMF，也能降低細(xì)胞膜透性和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，且Gi對提高杜鵑花耐熱性的效果最為顯著，這可能與不同AMF對杜鵑花品種 ‘筆止’根系的侵染率高低有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

表3 不同AMF耐熱性綜合評價Table 3 Comprehensive evaluation on heat resistance of different arbuscular mycorrhizal fungi

在干旱情況下，接種AMF能使連翹Forsythia suspensa葉片的細(xì)胞膜透性降低［19］。從本試驗結(jié)果來看，接種Gi，Gm和Ge真菌明顯降低了杜鵑花葉片的細(xì)胞膜透性，其中接種Gi效果最明顯，而接種Ge效果最差。說明在高溫條件下，接種不同的叢枝菌根真菌對寄主植株影響不同。丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的多少能夠反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度。本研究表明：高溫脅迫下，接種AMF在一定程度上降低植物體內(nèi)的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，表明接種AMF使杜鵑花葉片的細(xì)胞膜過氧化程度減緩，從而提高了杜鵑花的耐熱性。這和趙匠等［20］對黃檗Phellodendron amurense耐鹽能力和曹巖坡等［21］對鹽脅迫下蘆筍Asparagus的研究結(jié)果一致。脯氨酸是一種滲透保護(hù)劑，其積累量與植物的抗逆能力呈正相關(guān)?？扇苄蕴鞘侵参矬w內(nèi)滲透調(diào)節(jié)的小物質(zhì)分子，逆境條件下通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透壓來減輕細(xì)胞的機械損傷?？扇苄缘鞍踪|(zhì)具有較高的保水性，可提高植物的抗性。許平輝等［22］研究證明：在干旱脅迫下，接種AMF能夠增加茶樹Camellia sinensis體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本試驗也證明：高溫脅迫下接種AMF，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均隨著溫度增加而增加，表明杜鵑花在受到高溫脅迫時，這些物質(zhì)的積累可以減小細(xì)胞的傷害程度，從而提高植物的抗性。本研究結(jié)果表明：高溫脅迫下，隨著脅迫時間的增加，杜鵑花 ‘筆止’葉片的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低，但接種AMF植株葉片的葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素和總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于未接種組。表明接種AMF能有效增強植株的光合能力。該試驗結(jié)果與韓冰等［23］對苗期黃瓜Cucumis sativus和閆妍等［24］對低溫下番茄Lycopersicon esculentum幼苗的研究結(jié)果一致。高溫脅迫下，接種AMF的杜鵑花葉片厚度、柵欄比、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)緊密度均大于ck，其中接種Gi處理的杜鵑花葉片厚度、柵欄組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度與ck差異最顯著，而細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度則小于ck。常溫條件下，接種AMF的杜鵑花葉片與ck差異不大，該試驗結(jié)果與郭邵霞等［13］研究的高溫下牡丹Paeonia suffruticosa葉片解剖結(jié)果一致。

綜合分析表明：高溫脅迫對杜鵑花的葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)參數(shù)等均產(chǎn)生了顯著影響。接種AMF，一定程度上能緩解高溫脅迫對杜鵑花葉片組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜物質(zhì)、葉綠素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等所造成的傷害，提高杜鵑花的耐熱性。