四川省山藥黑斑病病原菌的鑒定

韓帥 張河慶 吳婕 李洪浩 席亞東

摘要為鑒定引起山藥莖蔓黑斑病的病原菌，本研究利用柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性，根據(jù)菌株的形態(tài)特征和基于rpb2基因序列分析進(jìn)行分類鑒定，并初步測定其寄主范圍。結(jié)果顯示：分離的2株病原菌分生孢子橢圓形，單胞，（3.9～5.1）umX（1.8～2.7）um，產(chǎn)孢細(xì)胞瓶梗形，分生孢子器近圓形或梨形，無剛毛，具孔口，有時孔口延長形成乳突，NaOH顏色反應(yīng)呈陽性，參考Phoma鑒定手冊，可將其劃分到section Peyronellaea。將供試茵的rpb2序列進(jìn)行BLAST比對分析，其與GenBank中的Epicoccumlatusicollum具有最高的同源性，支持率為97%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可將其鑒定為E latusicollum，該菌經(jīng)人工接種后也能侵染番茄、辣椒和花菜幼苗。

關(guān)鍵詞山藥黑斑病;病原鑒定;附球菌屬;rpb2序列分析

中圖分類號：S435.39文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A D01：10.16688/j.zwbh.2018156

山藥又名薯蕷，是一種藥食兩用的多年生草質(zhì)藤本植物，在我國的西北、華北及長江流域均有廣泛種植。由于山藥具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，近年來種植面積不斷擴(kuò)大，加上單一連作的栽培模式使病害逐年加重。在山藥栽培管理過程中常見的病害有枯萎病、褐斑病、炭疽病、根腐病，此外莖腐病、斑枯病、漆腐葉斑病也時有發(fā)生，這些病害已嚴(yán)重影響到山藥的產(chǎn)量和品質(zhì)。

莖點(diǎn)霉屬Phoma真菌擁有豐富的生態(tài)多樣性，通常被認(rèn)為是種類最多的真菌類群之一，已命名和描述的超過3000種。早期學(xué)者主要依據(jù)寄主類群和培養(yǎng)性狀來進(jìn)行分類，對于形態(tài)差異較小的物種，形態(tài)分類就顯示出一定的局限性。2004年Boerema等編寫出版了《Phoma Identification Manual》，將厚垣孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞、分生孢子和分生孢子器的形態(tài)學(xué)特征、菌落的培養(yǎng)性狀、NaOH顏色反應(yīng)以及寄主范圍作為分類依據(jù)，重新整理和修訂了莖點(diǎn)霉屬真菌，并將其分為九大部分，根據(jù)編制的檢索表可將供試菌劃分至其中一個部分，再劃分到種。這為供試菌在種屬水平上的準(zhǔn)確鑒定提供了有效的幫助，但部分分類單元之間的劃分界限仍然比較模糊，鑒定過程中供試菌可能同時擁有幾種分類單元的特征。分子生物學(xué)的快速發(fā)展為微生物的分類鑒定提供了新思路和新方法，Aveskamp等利用4個基因（LSU、SSU、ITS、tub2）對亞隔孢殼科Didy-mellaceae進(jìn)行多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育研究，對該科幾個單系進(jìn)化支進(jìn)行了分類學(xué)修訂，將原本屬于廣義莖點(diǎn)霉section Peyronellaea部分的Ph.sorghina、Ph.pimprina和E.nigrum轉(zhuǎn)至新建立的附球菌屬Epicoccum，該屬的典型特征為能夠產(chǎn)生深色的葡萄串狀的厚垣孢子。Chen等將rpb2與LSU、ITS和tub2三個位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析，對附球菌屬進(jìn)行了修訂和補(bǔ)充，加入了5種不產(chǎn)生厚垣孢子的原莖點(diǎn)霉屬真菌。隨后，Chen等使用相同方法對附球菌屬進(jìn)行了再次補(bǔ)充和完善，將9個新種納入其中，其中包括E latusicollum、E.viticis和E.duchesneae等5個不產(chǎn)生厚垣孢子的新種。關(guān)于附球菌屬真菌的研究主要集中于生物防治方面，CampbellEl62研究發(fā)現(xiàn)，黑附球菌E.pur-purascens對小麥禾旋孢腔菌Cochliobolus sativus有拮抗作用;室內(nèi)試驗(yàn)表明，黑附球菌可以減少核盤菌Sclerotinia sclerotiorum對萵苣的侵染;Mel-garejo等的研究表明，E nigrum能夠有效抑制桃褐腐菌Monilinia laxa;李寶年等認(rèn)為附球菌屬真菌對樟子松枯梢病病原菌Diplodia pinea具有拮抗作用。近幾年來，也有報道稱附球菌屬真菌能引起作物病害，E sorghinum會造成高梁根部變黑腐爛和種子腐爛，E.nigrum能引起枇杷葉片的褐斑病。

本研究于2016年從四川省攀枝花市米易縣采集山藥病樣，發(fā)現(xiàn)莖蔓上一種新的病害，采用柯赫氏法則回接驗(yàn)證，依據(jù)病原菌的菌落形態(tài)、分生孢子和分生孢子器的形態(tài)特征，結(jié)合rpb2基因序列建樹比對分析，確定病原菌的種類，從而為山藥病害的準(zhǔn)確識別和藥劑防治提供重要的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1植物材料和供試菌株

植物材料：山藥品種為‘雅山一號，病樣采自攀枝花米易縣埡口鎮(zhèn)和丙谷鎮(zhèn)。辣椒品種為‘香辣二荊條，花菜品種為‘碧玉，番茄品種為‘大紅番茄。供試菌株（編號為SY11和SY12）均從山藥發(fā)病莖蔓分離獲得，經(jīng)過單孢純化保存于4C冰箱備用。

1.2培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL;水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂6g，蒸餾水1000mL;燕麥瓊脂（oatmeal agar，OA）培養(yǎng)基：燕麥片20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL;麥芽浸膏（malt extract agar，EMA）培養(yǎng)基：麥芽膏40g，瓊脂12g，蒸餾水l 000mL。

1.3主要試劑

試劑及儀器：十六烷基三甲基溴化銨（hexade-cyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），Taq PCR Master Mix，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;Loading Buffer，生工生物工程（3c海）股份有限公司。

1.4病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離。病樣用清水沖洗干凈，自然風(fēng)干，使用消毒剪刀截取病健交界處5mmX 5n3In的組織塊，75%乙醇浸泡1min，然后用5%次氯酸鈉處理30s，無菌水漂洗3次后用無菌濾紙吸干水分，將組織塊接種至PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)。

菌株純化采用單孢分離法。收集菌株的分生孢子器，機(jī)械壓破后加入適量無菌水，取上清制成一定濃度的孢子懸浮液，均勻地涂布于PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)3～4d挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，獲得純菌株，待長滿后4C保存。

1.5病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將活化的純菌株轉(zhuǎn)接于OA、EMA和PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7d，測定菌落直徑，并記錄菌落的形態(tài)特征，同時在菌落邊緣滴加適量的10%NaOH溶液，在10min和1h后觀察并記錄培養(yǎng)基的顏色變化。黑暗培養(yǎng)7d后，將平板轉(zhuǎn)移至12h黑光燈照射、12h黑暗處理的人工氣候培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)7d，誘導(dǎo)分生孢子器的產(chǎn)生，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子、厚垣孢子和分生孢子器的形態(tài)特征，并測定20個分生孢子的大小，根據(jù)《PhomaIdentification Manual》中關(guān)于生長速度、顏色反應(yīng)以及分生孢子、分生孢子器和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征等描述細(xì)則來進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

2.5病原菌寄主范圍的研究

菌株SY11和SY12接種番茄苗莖基部3d后，菌餅周圍出現(xiàn)一圈水漬狀病斑，6d后病斑變?yōu)楹稚?，擴(kuò)展至整個莖基部，稍有縊縮，發(fā)病率為100%;接種辣椒苗4d后，接種部位開始變褐，6d后病斑擴(kuò)大并且凹陷，其發(fā)病率分別為85%和90%;接種花菜幼苗4d后，接種部位出現(xiàn)不規(guī)則褐色病斑，6d后病斑中心變?yōu)楹谏砻婷懿及咨z，其發(fā)病率分別為70%和80%;SY11接種豇豆苗未發(fā)病，SYl2發(fā)病率為10%，癥狀表現(xiàn)為粉色的稍凹陷病斑。結(jié)果表明，兩個菌株能侵染辣椒、番茄和花菜，它的寄主范圍可能包括茄科和十字花科作物，但對豇豆的侵染力非常有限。

3討論

山藥是四川攀枝花米易縣重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，近年來由于山藥的規(guī)?；N植，重茬嚴(yán)重，品種也較為單一，病害日益加重，經(jīng)過病害調(diào)查和鑒定，當(dāng)?shù)赜赡z孢炭疽菌引起的炭疽病、尖孢鐮刀菌和鏈格孢屬真菌引起的葉斑病較為常見。我們在山藥莖蔓上發(fā)現(xiàn)了一種新病害，癥狀為莖蔓生有橢圓形至梭形的黑斑，病斑中心開裂稍凹陷，之后連成一片至莖蔓枯死。本研究對引起攀枝花山藥莖蔓黑斑病的兩株真菌進(jìn)行了分離和鑒定，并通過柯赫氏法則驗(yàn)證分離菌株為致病菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)特征和基于rbp2序列的分子鑒定，確定分離菌株為E.1atusicollum，屬于子囊菌門、亞隔孢殼科、附球菌屬真菌。

附球菌屬于2010年由Aveskamp等建立，經(jīng)過后續(xù)的補(bǔ)充和完善，現(xiàn)有16個屬。Chen等通過多基因序列分析，將E.1atusicollum納入到附球菌屬中，并對菌株編號為LC 5158（從高梁中分離獲得）的E latusicollum的形態(tài)學(xué)特征和菌落培養(yǎng)性狀作了描述。本研究分離到的菌株SYll和SYl2與LC 5158形態(tài)學(xué)特征基本一致，也和Phoma鑒定手冊對section Peyronellaea的描述基本相符，只是未見厚垣孢子，但能觀察到菌絲中問或末端分化出的串珠狀的近圓形膨大細(xì)胞，有的呈粉色，與Ph.anserina和Ph.eucalyptica在培養(yǎng)基上形成的膨大細(xì)胞類似，這可能是形成厚垣孢子的前體細(xì)胞。同時，SYll和SYl2在PDA培養(yǎng)基上的生長速度快于OA和MEA培養(yǎng)基，NaOH反應(yīng)是由墨綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?，呈陽性，這與LC 5158培養(yǎng)性狀一致，但是菌絲顏色和產(chǎn)生的色素有所不同，SYll和SYl2的菌絲呈橙色或粉色，培養(yǎng)基呈淺粉色至紫色，且SYl2能產(chǎn)生紫紅色的同心輪紋，而LC 5158的菌絲為煙灰色至暗綠色，這可能是因?yàn)镋.1atusicollum的地理特異性較明顯。

通常情況下，子囊菌門真菌rpb2單基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與18S rDNA高度契合，Chen等認(rèn)為rpb2單基因的系統(tǒng)發(fā)育樹與多基因結(jié)合的系統(tǒng)發(fā)育樹非常吻合，且rpb2基因在種問和屬問關(guān)系上顯示出比ITS更好的區(qū)分度。本研究利用rDNA-ITS和rpb2基因分別進(jìn)行建樹分析，結(jié)果顯示基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（本文未列出）不能鑒定到種，而rpb2基因能將分離菌株與附球菌屬的E latusi-collum聚為一支，并且在種問表現(xiàn)出很好的區(qū)分度。

國內(nèi)外關(guān)于E latusicollum的報道極少，目前僅限于分類水平上的研究，只是在個別文獻(xiàn)中有所提及，該菌主要分離自黃荊、野山茶、高梁、掌葉槭和羅漢松等植物，常被認(rèn)為屬于內(nèi)生菌、腐生菌或半寄生菌，對該菌病理學(xué)方面的研究較少。本研究首次報道了山藥莖蔓上的一種新病害，通過組織分離、柯赫氏法則驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，試驗(yàn)結(jié)果表明引起山藥莖蔓黑斑病的病原菌為E.la-tusicollum，并初步確定該菌能侵染茄科和十字花科的個別作物，這為該病害的正確識別及防治方法的篩選提供了基礎(chǔ)。