一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系MYO6基因新致病性變異△

田濤 魯雅潔 姚俊 曹新 魏欽俊 李琦,3

據(jù)估計，約70%的遺傳性聽力損失(hereditary hearing loss， HHL)是非綜合征型(nonsyndromic autosomal hearing loss, NSHL)，其余30%被歸類為綜合征型聽力損失[1，2]。常染色體隱性遺傳類型的NSHL(autosomal recessive NSHL，ARNSHL)通常表現(xiàn)為語前聾，約占聽力損失患者的80%，而常染色體顯性遺傳NSHL(autosomal dominant NSHL，ADNSHL)大部分是漸進性語后聽力損失，約占20%[3]。目前至少有100個耳聾相關(guān)基因已被鑒定，其中包括36個ADNSHL相關(guān)基因(http://hereditaryhearingloss.org，09/2017)。由于ADNSHL多為散發(fā)且家系罕見，其HHL的分子診斷仍然具有挑戰(zhàn)性[4]。

以往耳聾家系致病基因的鑒定主要采用候選基因篩選和連鎖分析定位克隆等技術(shù)，復雜而且時間較長，存在一定的局限性。目前，全外顯子組測序已成為闡釋HHL復雜性的最合適和最可靠的工具[5～7]。故本研究采用全外顯子組測序調(diào)查一個中國ADNSHL家系(JSNY-067)的遺傳病因，發(fā)現(xiàn)了MYO基因的新致病性變異，報告如下。

1 資料與方法

1.1家系資料 一個6代共52人的ADNSHL大家系(圖1，編號為JSNY-067家系)，家系調(diào)查和聽力學檢測由南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科完成。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學人類研究所倫理委員會批準，所有家系成員已經(jīng)書面簽字同意赫爾辛基宣言的所有原則。

該家系六代居住于江蘇省，14例表現(xiàn)為語后ADNSHL，均為雙側(cè)對稱的感音神經(jīng)性聽力損失，聽閾圖表現(xiàn)為平坦型或者高頻下降型；聽力損失程度似乎與個體的年齡相關(guān)，家系中聽力損失者均主訴聽力障礙在學齡時出現(xiàn)，隨著年齡增加聽力損失呈進行性加重，早期為中高頻聽力損失，逐漸影響所有頻率呈平坦型聽閾曲線，兩名年齡最小的患者(5歲和10歲患者)感音神經(jīng)性聽力損失僅影響中低頻，其中2例(Ⅳ3、Ⅴ3)典型聽閾圖見圖2。

所有聽力損失者其他耳鼻咽喉科?？茩z查均正常，無耳毒性藥物應(yīng)用史和噪聲暴露史，無主觀和客觀的前庭功能障礙表現(xiàn)，無耳鳴，鼓室導抗圖正常，全身檢查神經(jīng)系統(tǒng)正常，未發(fā)現(xiàn)視力障礙和視網(wǎng)膜病變。

1.2DNA提取和全外顯子組測序 抽取所有參與調(diào)查家系成員的外周靜脈血，按照標準程序提取基因組DNA。使用DNA提取試劑盒(DP319，Tiangen，Beijing，China)從受試者的血液中提取基因組DNA,使用耳聾基因變異檢測試劑盒(Capital Bio Corporation，Beijing，China )檢測中國人群四種常見耳聾基因(GJB2、SLC26A4、GJB3和MT-RNR1)中的9種熱點致病性變異，包括：GJB2的35delG、176del16、235delC、299delAT, GJB3的538C>T，SLC26A4的2168A>G、919-2A>G, MT-RNR1的1494C>T、1555A>G[8]。

圖1 JSNY-067家系的家系圖 黑色箭頭是先證者

圖2 2例典型聽力損失患者(Ⅳ3、Ⅴ3)的聽閾圖 平均聽閾(pure tone audiometry,PTA)分別為58.3 dB HL(Ⅳ3)、41.7 dB HL(Ⅴ3)

參照說明書， 將約3 μg純化的gDNA片段化至200 bp，對文庫制備進行末端修復，腺苷酸化和銜接子連接。使用TruSeq DNA LT / HT樣品制備試劑盒和TruSeq Exome Enrichment Kit富集外顯子組，合并等量的文庫樣品，然后與定制的捕獲陣列雜交，包括外顯子、剪接位點和立即融合內(nèi)含子序列。 在Illumina HiSeq 2500上進行測序，用于變異鑒定和隨后的分析。 Samtools mpileup識別變體并標記SNP和插入缺失，ANNOVAR用于注釋基因。

1.3Sanger測序和變異功能分析 運用Sanger測序?qū)SNY-067家系的所有成員的樣品進行測序以確定變異基因中的致病性變異，尤其是MYO6基因致病性變異。 使用BigDye Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)對PCR產(chǎn)物進行測序，并使用ABI 3700XL測序儀進行測序分析。MYO6測序的引物如下：MYO6-正向：5'TGTCCCGCCCATGTTAATAT 3'; MYO6反向：5'TGCACCGTACCTCAACACAG 3'。

1.4變異位點保守性分析 使用SIFT、Polyphen2、PROVEAN和MutationTaster軟件來確定影響表型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能變化。使用Clustal X1.83軟件比較人類野生型MYO6蛋白序列與來自黑猩猩、小家鼠、抹香鯨、野豬、食蟹猴、雙峰駱駝、鼠耳蝙蝠、埃及果蝠、牛、大熊貓、白豚、八齒鼠、原雞和熱帶爪蟾的MYO蛋白序列(序列見http://www.ensembl.org/)，并研究這種蛋白質(zhì)的進化保護和結(jié)構(gòu)預測。

2 結(jié)果

2.1JSNY-067家系聽力損失特點 JSNY-067家系中14例語后ADNSHL患者中1例(Ⅲ10)已經(jīng)去世，未測聽力，其余13例的聽力損失發(fā)生年齡及特點見表1，可見，聽力損失程度隨年齡增長呈逐漸加重的趨勢，年齡越小，聽力損失程度越輕，年齡越大，聽力損失程度越重。

2.2基因檢測結(jié)果 為了搜尋耳聾候選基因，本研究對該家系的一例聽力正常(Ⅲ13)個體和兩例聽力損失(Ⅳ3和Ⅴ3)個體的DNA進行了全外顯子組測序。 每例個體平均生成46.7億個堿基，目標區(qū)域的平均測序深度約為97個，以滿足單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失的要求。 將測序數(shù)據(jù)與NCBI人參考基因組進行比對，并與包含來自1000基因組計劃試驗數(shù)據(jù)的dbSNP138，來自八個測序的HapMap個體和來自YH數(shù)據(jù)庫的10個個體進行比較。

表1 JSNY-067家系13例聽力損失患者的聽力損失發(fā)生年齡、特點及程度

在2例個體總共發(fā)現(xiàn)了7 898種變異，其中5 760個是非同義變異，包括剪切位點變異、點變異以及插入缺失。 然后將這些變異根據(jù)以下原則進行篩選：①變體的等位基因頻率cuto(在dbSNP138，HapMap，1000基因組和本地數(shù)據(jù)集中小于0.01);②在所有受影響的個體中發(fā)現(xiàn)的變異，在未受影響的個體中沒有發(fā)現(xiàn)，進一步將候選變異縮減為25個錯義變異。

通過Sanger測序篩選譜系樣本中發(fā)現(xiàn)的25個變異，在MYO6基因的外顯子8中發(fā)現(xiàn)了與該疾病共分離的錯義變異c.622A> G(p.K208E)(圖3)，該變異在該家系中13個聽力損失成員中發(fā)現(xiàn)，但在21個聽力正常的家系成員中未發(fā)現(xiàn)。 為了評估其是否為致病性變異，進一步測序了500個漢族健康人和300個散發(fā)性耳聾病例，均未發(fā)現(xiàn)c.622A> G變異。

2.3變異位點保守性分析結(jié)果 為了預測該變異的可能致病性，本研究分析了氨基酸替換的進化保守性和破壞性效應(yīng)， 結(jié)果顯示，該變異在多種脊椎動物物種間高度保守，MYO6蛋白中208位的Pro殘基在多種脊椎動物物種中高度保守(圖3b)，當這個位置改變時，引起致病性變異的可能性大大增加。進一步在計算機中使用SIFT，Polyphen2，PROVEAN和MutationTaster軟件預測了變異危害的可能性，預測分析的結(jié)果見表2。MYO6基因編碼非常規(guī)肌球蛋白VI，可以分為三個區(qū)域：N-末端運動區(qū)域，接頭結(jié)構(gòu)域和單個IQ基序組成的頸部結(jié)構(gòu)域，以及具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的C末端尾區(qū)域。p.K208E變異可能影響驅(qū)動子部位的截短蛋白(圖3b)，表明，MYO6新的變異c.622A> G(p.K208E)可能是這個家系發(fā)生聽力損失的原因。

表2 JSNY-067家系MYO6基因的致病性變異特性

注：a.得分范圍從0(有害)到1(中性)，截止分數(shù)設(shè)置為0.05。b.負分和正分分別表示有害和中性，截止分數(shù)設(shè)置為-2.5。 評分等于或低于-2.5的變異被認為是“有害的”，高于-2.5被認為是“中性的”。c.HGMD(Human Gene Mutation Database，人類基因變異數(shù)據(jù)庫)

圖3 JSNY-067家系MYO6基因的變異分析 a.野生型和c.622A> G變異對照的DNA序列。b.由運動、IQ和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的肌球蛋白VI的圖結(jié)構(gòu), 顯示p.K208E變異在驅(qū)動子頭部區(qū)域中映射,保守性分析表明,肌球蛋白VI蛋白中208位的Pro殘基在多種脊椎動物物種中保守

3 討論

聽力損失的基因診斷目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是由于遺傳異質(zhì)性使得分子診斷昂貴而耗時。全外顯子組測序是鑒定孟德爾遺傳中的致病基因變異的有效方法，與Sanger測序相比，具有明顯的成本效益性[9]。本研究對一個中國耳聾家系進行研究，該家系聽力損失患者表現(xiàn)為漸進性的語后聾，符合ADNSHL的遺傳學特征，通過對該家系進行全外顯子組測序，成功鑒定了導致該家系遲發(fā)性聽力損失的新的MYO6變異c.622A> G(p.K208E)。

MYO6基因位于染色體6q14.1，含有35個外顯子，構(gòu)成3 858個多核苷酸編碼區(qū)[10]。已知MYO6基因中的變異可以引起ADNSHL(DFNA22)和ARNSHL(DFNA37)。 迄今為止，全世界許多國家的不同DFNA22家族報道了11種MYO6致病變異[11]，MYO6致病 變異似乎在外顯子2～35中自由分布，只有兩個突變(p.Arg205Stop，p.Arg205Gln)位于p.K208E附近，臨床表型均不是ADNSHL。MYO6基因編碼非常規(guī)肌球蛋白-VI，其是一種反向運動蛋白，向肌動蛋白絲的負端移動，并在細胞內(nèi)囊泡和細胞器運輸中發(fā)揮作用[12]。 蛋白質(zhì)由含有ATP-和肌動蛋白結(jié)合位點的運動區(qū)域和與其他蛋白質(zhì)相互作用的球狀尾巴組成[13]。 肌球蛋白-VI有助于維持內(nèi)耳毛細胞的結(jié)構(gòu)完整性和適當?shù)墓δ?，MYO6錯義變異可能抑制野生型肌球蛋白VI二聚化并抑制其功能[14]。

在本研究JSNY-067家系中，先證者(Ⅴ3)具有雙側(cè)對稱的感音神經(jīng)性聽力損失，聽閾圖呈高頻下降型，10歲左右開始發(fā)病，2例年齡最小的受影響受試者(5歲和10歲)感音神經(jīng)性聽力損失僅影響中低頻，隨后聽力損失漸進性發(fā)展，受影響的家庭成員表現(xiàn)為早期僅高頻聽力下降，隨著年齡增加全頻聽力下降。染色體6q13上的MYO6基因的外顯子8中鑒定發(fā)生了錯義變異c.622A> G，這導致用蛋白質(zhì)殘基208 (K208E)處的谷氨酸置換賴氨酸。在500例漢族健康人和300例散發(fā)耳聾病例均未發(fā)現(xiàn)p.K208E變異，考慮MYO6基因的c.622A>G(p.K208E)變異是JSNY-067家系的致病變異，該變異型肌球蛋白Ⅵ可能導致ADNSHL，其影響蛋白質(zhì)的致病性還有待進一步研究。