依托咪酯聯(lián)合富氫液對膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激、炎癥損傷情況及血清HMGB1、MDA水平的影響分析

全宗宗，羅海鳴

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 麻醉科，上海 201999)

膿毒癥常由感染、嚴重創(chuàng)傷、大手術(shù)后、燒傷等誘發(fā)引起的機體免疫反應(yīng)，其來勢兇猛、進展迅速，極易引發(fā)膿毒癥休克及多器官功能障礙，病死率高至28%～47%[1-2]。隨著對膿毒癥研究的深入，發(fā)現(xiàn)其生理機制錯綜復雜，包括宿主、炎癥、免疫和異常凝血等多方面因素，伴隨微循環(huán)、代謝以及細胞功能的改變。而過度的炎癥反應(yīng)仍是其最常見機制。依托咪酯是臨床常用的靜脈麻醉藥物之一，有研究表明其可顯著減少手術(shù)應(yīng)激病人體內(nèi)炎癥因子的水平[3]。另外，近年來發(fā)現(xiàn)氫氣有抗炎和抗氧化的效用，同時富氫液制備簡單、價格便宜，且未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[4]。血清高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)是晚期的炎癥介質(zhì)，由其它炎癥因子誘發(fā)產(chǎn)生，并正反饋加劇炎癥反應(yīng)[5]。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)最終的過氧化產(chǎn)物，其含量可反映體內(nèi)氧自由基的水平，衡量氧化應(yīng)激的損傷程度[6]。本次實驗通過對膿毒癥小鼠腹腔注射依托咪酯或者依托咪酯聯(lián)合富氫液，觀察其氧化應(yīng)激損傷情況，并觀察其對組織中HMGB1和MDA水平的影響，進一步探究膿毒癥病人靜脈所用麻醉藥的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組 選取72只由上海交通大學醫(yī)學院動物中心所提供的雄性Balb/c小鼠，體重在15～20 g，許可證號為SCXK(滬)2018-0007。以隨機數(shù)字表法分成四組，每組18例，依托咪酯組在膿毒癥模型建立后予依托咪酯處理，聯(lián)合組在膿毒癥模型建立后予依托咪酯聯(lián)合富氫液處理。本次實驗動物處理方法均符合動物的倫理標準，并經(jīng)本院動物管理委員會批準。

1.2 處理方法

1.2.1 藥品及試劑 LPS(純度98%，美國Sigmar公司，L2880)，使用前以無菌生理鹽水溶解成濃度為2 mg/mL，-20 ℃保存；依托咪酯脂肪乳注射液(商品名：福爾利，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20020511)；富氫液(氫氣濃度0.6 mmol /L的生理鹽水，上海碧云天生物公司)；IL6、IL10、HMGB1、MDA 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國R&D公司)。

1.2.2 建立膿毒癥模型 參照相關(guān)文獻[7]采取小鼠腹腔注射LPS建立膿毒癥模型，結(jié)合實驗的預期結(jié)果，進行LPS劑量的確定。方法：實驗前小鼠予禁食12 h、可自由飲水。以無菌的生理鹽水溶解LPS為2 mg/mL，除正常對照組外均腹腔注射20 mg/kg的LPS，同時記錄起始時間。

1.2.3 實驗動物的給藥 正常對照組：生理鹽水0.2 mL腹腔注射；模型制備后0.5 h，依托咪酯組：依托咪酯10 mg/kg腹腔注射；聯(lián)合組：依托咪酯10 mg/kg+富氫液5 mL/kg腹腔注射。

1.3 標本的采集和處理 在注射LPS后2、6 h每組分別取9只小鼠進行血液及肝、腎、肺組織標本的收集。血液標本：運用眼球摘除取血方法，收集血液約0.5 mL，以4 000 rpm離心10 min，取上層血清放置在-20 ℃的冰箱待測定。組織標本：將小鼠斷頸處死，置于冰臺上取其右肺下葉、右腎皮質(zhì)及肝右葉，添加生理鹽水，以玻璃勻漿器進行手工勻漿，將其制備為10%的組織勻漿，以3 000 rpm離心15 min，取上清液放置在-20 ℃冰箱待測。

1.4 觀察指標

1.4.1 血清IL6及IL10的檢測 運用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定4組小鼠血清中IL6及IL10的濃度，整個實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.2 組織HMGB1及MDA的檢測 運用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分別檢測各組小鼠肝、腎、肺組織中HMGB1及MDA水平，整個實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般癥狀觀察 正常對照組小鼠反應(yīng)敏捷，精力旺盛，毛發(fā)光澤，活動能力、飲食、大小便均正常；注射LPS之后，小鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸加快、抱團取暖、活動低下、飲食減少、毛發(fā)凌亂聳立無光澤及解稀水樣便，符合膿毒癥的臨床發(fā)病特點；給予依托咪酯或依托咪酯聯(lián)合富氫液后，小鼠進食量、活動量明顯增加，呼吸、精神、毛發(fā)等情況也有所好轉(zhuǎn)，并以聯(lián)合給藥組效果更為明顯。

2.2 4組小鼠血清中IL6及IL10含量比較 IL6含量：與正常對照組相比，膿毒癥組2、6 h的IL6均顯著升高，與膿毒癥組相比，依托咪酯組及聯(lián)合組2、6 h的IL6均顯著降低，與依托咪酯組相比，聯(lián)合組2、6 h的IL6顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義，P均<0.05；IL10含量：與正常對照組相比，膿毒癥組2、6 h的IL10均顯著降低，與膿毒癥組相比，依托咪酯組及聯(lián)合組2、6 h的IL10均顯著升高，與依托咪酯組相比，聯(lián)合組2、6 h的IL10顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義，P均<0.05(見表1)。

項目時間(h)正常對照組膿毒癥組依托咪酯組聯(lián)合組IL62616.06±4.7515.78±7.12107.09±7.92a 102.79±10.28a 66.18±3.35b74.06±7.58b43.25±3.22bc36.19±2.98bcIL1026295.65±26.58262.56±15.4982.04±20.74a87.24±21.45a230.94±24.41b189.98±17.98b278.34±20.35bc223.64±18.76bc

a：與正常對照組比較，P<0.05；b：與膿毒癥組比較，P<0.05；c：與依托咪酯組比較，P<0.05。

2.3 4組小鼠肝組織中HMGB1、MDA含量比較 與正常對照組比較，膿毒癥組6 h肝、腎、肺組織中HMGB1、MDA含量均明顯升高，與膿毒癥組比較，依托咪酯組及聯(lián)合組6 h各組織的HMGB1、MDA含量明顯降低，并且聯(lián)合組的HMGB1、MDA含量顯著低于依托咪酯組，均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05，見表2)。

項目組織正常對照組膿毒癥組依托咪酯組聯(lián)合組HMGB1(μg/g)肝2.2±0.411.3±2.5a7.2±1.7b4.3±1.2bc腎2.4±0.510.5±2.3a6.9±1.3b4.0±0.8bc肺3.2±0.713.6±2.9a7.9±1.8b5.2±1.1bcMDA(nmol/mL)肝4.89±1.2218.88±2.01a13.28±1.49b8.52±1.44bc腎4.63±1.8215.92±2.11a10.99±1.33b5.74±2.13bc肺2.99±1.0315.73±1.57a10.25±1.75b5.13±2.21bc

a：與正常對照組比較，P<0.05；b：與膿毒癥組比較，P<0.05；c：與依托咪酯組比較，P<0.05。

3 討論

膿毒癥是一種全身炎癥性反應(yīng)的綜合征，常常與機體過度炎癥反應(yīng)相關(guān)，當宿主被病原體感染后，體內(nèi)的促炎因子和介質(zhì)被誘導生成及釋放，相互影響并放大，形成炎癥網(wǎng)絡(luò)。雖然目前擁有先進的監(jiān)護設(shè)備和診療技術(shù)，但膿毒癥病情進展迅速，其發(fā)病率及病死率均高，仍然是醫(yī)學界所面臨的難題，也是近年來造成住院患者發(fā)生死亡的重要原因[8]。依托咪酯作為一種靜脈麻醉藥，有研究[6]表明在膿毒癥的小鼠中可顯著減輕炎性反應(yīng)。此外，以氫氣制備而成的富氫液則可有效減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激[9]，這與張秉新等[10]研究氫氣能有效降低膿毒癥所致炎癥因子釋放及減輕脂多糖誘發(fā)炎癥反應(yīng)一致。因膿毒癥主要由于革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的LPS刺激單核巨噬細胞，進一步釋放IL1、TNF-α等大量的炎性介質(zhì)，級聯(lián)放大誘導全身炎癥反應(yīng)形成膿毒癥。故本次實驗以LPS制備膿毒癥小鼠模型，觀察依托咪酯聯(lián)合富氫液對小鼠的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷情況。

當發(fā)生膿毒癥時，體內(nèi)會釋放大量的炎癥因子。IL-6屬于促炎因子，常反映細胞因子的級聯(lián)激活，與疾病的嚴重程度密切相關(guān)，可判斷膿毒癥的預后[11]。而IL-10則屬于內(nèi)源性的抗炎介質(zhì)，常由內(nèi)毒素及促炎因子誘導生成，可有效抑制炎癥細胞分泌炎癥因子，尤其可顯著抑制由LPS誘發(fā)促炎介質(zhì)的生成[12]。血清高遷移率族蛋白B1(HMGB1)屬于晚期炎癥介質(zhì)，由其它炎性因子誘發(fā)產(chǎn)生[5]。有關(guān)研究[13]也表明膿毒癥發(fā)生時能刺激IL-1β、TNF-α及HMGB等多種炎癥因子釋放。本次實驗結(jié)果顯示：2 h、6 h膿毒癥組的IL6含量及6 h膿毒癥組的HMGB1均較正常對照組升高，而依托咪酯組及聯(lián)合組的均較膿毒癥組降低，且聯(lián)合組均顯著低于依托咪酯組；2 h、6 h膿毒癥組的IL10含量較正常對照組降低，而依托咪酯組及聯(lián)合組的均較膿毒癥組升高，且聯(lián)合組均顯著高于依托咪酯組。提示膿毒癥發(fā)生時炎癥因子IL6、HMGB1升高，而抗炎因子IL10降低，依托咪酯可有效降低IL6、HMGB1并升高IL10的含量，但聯(lián)合富氫液則效果更顯著。推測可能為以LPS制備小鼠膿毒癥模型，LPS誘發(fā)促炎介質(zhì)的生成，故膿毒癥組小鼠血清中IL6、HMGB1顯著高于正常對照組、IL10顯著低于正常對照組，而依托咪酯可抑制促炎因子TNF-α及IL-6的生成[14]，富氫液中的H+也可降低TNF-α及IL-6水平抑制炎癥反應(yīng)[15]。二者相互協(xié)同進一步減少了IL6的生成及由此誘發(fā)的HMGB1的產(chǎn)生，并負反饋升高IL10的水平。

近年來研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥的重要發(fā)病機制還包括氧自由基的病理性增多、氧化及抗氧化的失衡[16]。當自由基與脂質(zhì)相互作用引起過氧化化學反應(yīng)時所形成的終末氧化產(chǎn)物MDA是由細胞膜性成分作及自由基組成，常表示機體的氧自由基生成及活性，間接反映過氧化應(yīng)激的損傷情況，常用于其氧化應(yīng)激水平的評估[17]。本次研究結(jié)果顯示：6 h膿毒癥小鼠肝腎肺組織MDA含量較正常對照組升高，而依托咪酯組及聯(lián)合組的均較膿毒癥組降低，且聯(lián)合組均明顯低于依托咪酯組。提示膿毒癥發(fā)生時，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，組織中MDA升高。依托咪酯可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷降低MDA水平，但聯(lián)合富氫液時效果更佳。藥理研究表明依托咪酯不僅可以麻醉，同時還能擴張血管、減少機體耗氧量。相關(guān)研究證實依托咪酯有較強抗氧化作用[18]。富氫液所含H+可選擇性清除氧自由基及活性氮并有效抑制氧化損傷及緩解缺血再灌注引起的器官損傷[19]。分析可能為二者聯(lián)用，抗氧化作用疊加所致。

綜上所述，依托咪酯聯(lián)合富氫液可有效減少膿毒癥小鼠血清中IL6及肝肺腎組織中HMGB1的含量、升高血清中IL10的含量以抑制炎性反應(yīng)，并降低膿毒癥小鼠肝肺腎組織中MDA的水平減輕氧化應(yīng)激損傷。但本研究的實驗結(jié)果尚需更大樣本動物實驗和臨床實驗進一步研究證實。