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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定鹽堿脅迫金銀花中3種內(nèi)源激素

    2019-07-22 01:32:45李天雪胡玉濤韋笑
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:鹽堿內(nèi)源茉莉

    李天雪 胡玉濤 韋笑

    摘要:建立同時(shí)測(cè)定金銀花中水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法,并應(yīng)用于鹽堿脅迫下的金銀花分析。激素經(jīng)異丙醇/甲酸溶液(99/1,體積分?jǐn)?shù))提取后,通過(guò)固相萃?。⊿PE)柱凈化。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸溶 液- 乙腈;體積流量為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為3 μL;質(zhì)譜采用電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行測(cè)定。3種內(nèi)源激素具有良好的線性關(guān)系(R2≥0.998),最低定量限均為0.5 μg/L,穩(wěn)定性良好,提取回收率在 81.5%~93.8%之間,精密度的RSD值為2.7%~7.9%之間,該法快速可靠,可適用于其他植物中SA、ABA和JA的含量檢測(cè)。利用該方法測(cè)定鹽堿脅迫下金銀花中的3種內(nèi)源激素,比較分析它們?cè)邴}堿脅迫下的含量變化規(guī)律,為內(nèi)源激素對(duì)植物的逆境調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:金銀花;鹽堿脅迫;水楊酸;脫落酸;茉莉酸;定量;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

    中圖分類(lèi)號(hào):S567.7+90.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A? 文章編號(hào):1002-1302(2019)11-0229-05

    江蘇省地處黃海之濱,沿海鹽堿灘涂面積達(dá)到 0.76萬(wàn)km2,引種經(jīng)濟(jì)型耐鹽植物,可更有效地開(kāi)發(fā)利用鹽堿灘涂土地資源。金銀花是一種能耐鹽堿、耐干旱的多年生灌木植物,此外,金銀花作為一種常用中藥,具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱、保肝利膽等作用,因有較高的觀賞和藥用價(jià)值,是理想的鹽堿地經(jīng)濟(jì)植物[1]。鹽堿脅迫對(duì)作物產(chǎn)量、植物幼苗生理特性有顯著影響[2-6],植物內(nèi)源激素作為信號(hào)分子,在調(diào)節(jié)植物代謝以提高植物對(duì)逆境的抗性方面起著關(guān)鍵作用[7],內(nèi)源激素主要有水楊酸(salicylic acid,SA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA),研究?jī)?nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,可有助于金銀花抗逆境機(jī)制的研究,為金銀花在鹽堿灘涂的大面積種植提供一定的技術(shù)參考。

    ABA是在高等植物中含量較高的植物激素,與種子休眠、幼苗生長(zhǎng)、葉子脫落、氣孔運(yùn)動(dòng)等都有著密切的關(guān)聯(lián),同時(shí)也是主要的應(yīng)激激素,以調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)[8-9]。SA和JA都是特定生育環(huán)境刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物激素,SA是植物生長(zhǎng)抑制劑,抑制頂端分生組織生長(zhǎng),促進(jìn)側(cè)枝生長(zhǎng),屬于一種重要的調(diào)控植物抗逆反應(yīng)的應(yīng)激激素,研究表明,鹽脅迫下,SA可促進(jìn)根莖生長(zhǎng),增加植株的鮮質(zhì)量[10-11]。JA是參與植物抗性反應(yīng)的一種重要信號(hào)分子[12],在調(diào)控植物種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、幼苗發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老等方面起著重要的作用,尤其在植物干旱、鹽脅迫等逆境脅迫應(yīng)答中作用更為明顯[13-15]。各種激素相互協(xié)同參與調(diào)控植物的生理過(guò)程,因此,同時(shí)測(cè)定SA、ABA和JA含量對(duì)金銀花植物生理、逆境發(fā)育和作物生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究具有重要意義。

    目前植物激素的檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫(ELISA)法[16-17]、毛細(xì)管電泳法[18-19]、電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)法[20]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[21]、高效液相色譜(HPLC)法[22-25]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[8,26-29]。因超高效色譜分離技術(shù)的應(yīng)用,加上質(zhì)譜的精確性高、選擇性強(qiáng),超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法被認(rèn)為是測(cè)定內(nèi)源植物激素最靈敏、可靠的方法[30]。本研究建立了UPLC-MS/MS法并用其同時(shí)檢測(cè)金銀花中SA、ABA和JA這3種內(nèi)源植物激素,并用于鹽堿脅迫下金銀花樣品的分析,研究結(jié)果將為植物內(nèi)源激素的合理開(kāi)發(fā)、金銀花的高效培育提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    安捷倫1290 Infinity LC-6460 QqQ三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有G4220A四元低壓梯度泵和MassHunter Version B.04.00工作站(美國(guó)安捷倫科技公司);Oasis HLB SPE柱(規(guī)格3 cc/60 mg,美國(guó)沃特世公司);Visiprep 24TM DL固相萃取儀(美國(guó)Supelco公司);Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);氮吹儀N-WVAPTM 112(美國(guó)Organomation公司)。

    標(biāo)準(zhǔn)品SA、ABA和內(nèi)標(biāo)阿魏酸由南通經(jīng)緯生物科技有限公司提供,JA購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,純度均≥99%;甲醇(Sigma公司)、乙腈(Merk公司)、甲酸(上海安譜公司)為色譜純;超純水經(jīng)過(guò)Milli-Q系統(tǒng)純化制備;其余試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

    1.2 儀器條件

    色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈,梯度洗脫:0~3 min,10%~40%乙腈;3~6 min,40%~60%乙腈;6~8 min,60%~80%乙腈;系統(tǒng)平衡3 min;體積流量 0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量3 μL。

    質(zhì)譜采用電噴霧負(fù)離子源(ESI-源),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);駐留時(shí)間為50 ms;檢測(cè)電壓:3.5 kV;離子源溫度:120 ℃;錐孔電壓:220 V;脫溶劑溫度:350 ℃;脫溶劑氣體(N2)體積流量:8 L/min;鞘氣流速:11 L/min。SA、ABA和JA檢測(cè)離子的質(zhì)核和碰撞電壓分別是質(zhì)荷比137→93,35 eV;質(zhì)荷比263→153,15 eV和質(zhì)荷比209→59,14 eV。MRM質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

    1.3 樣品處理

    [8]蘇 適,李瑞航,郎丹瑩,等. 用改進(jìn)的SPE-LC-ESI-MS/MS法測(cè)定小麥葉片ABA含量[J]. 分子植物育種,2015,13(8):1850-1856.

    [9]侯升杰,朱 江,丁明玉. 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定冬青芽中的脫落酸[J]. 分析試驗(yàn)室,2009,28(3):96-98.

    [10]Jayakannan M,Bose J,Babourina O,et al. Salicylic acid in plant salinity stress signalling and tolerance[J]. Plant Growth Regulation,2015,76(1):25-40.

    [11]Morad M,Sara S,Mohammad D,et al. Effect of salicylic acid on alleviation of salt stress on growth and some physiological traits of wheat[J]. International Journal of Biosciences,2013,3(2):20-27.

    [12]李夢(mèng)莎,閻秀峰. 植物的環(huán)境信號(hào)分子茉莉酸及其生物學(xué)功能[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(23):6779-6788.

    [13]馮孟杰,徐 恒,張 華,等. 茉莉素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào),2015,51(4):407-412.

    [14]巫建華,賈思振,馮英娜,等. 茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因FaOPR3調(diào)控草莓果實(shí)成熟[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32(5):1148-1154.

    [15]郭正兵,韓柏明,郭 強(qiáng). 茉莉酸甲酯對(duì)高溫脅迫、生物蠶食無(wú)花果幼苗的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(20):138-143.

    [16]Quarrie S A,Whitford P N,Appleford N E,et al. A monoclonal antibody to(S)-abscisic acid:its characterization and use in radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves[J]. Planta,1988,173(3):330-339.

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    [19]Ross A R,Ambrose S J,Cutler A J,et al. Determination of endogenous and supplied deuterated abscisic acid in plant tissues by high-performance liquid chromatography-electro-spray ionization tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring[J]. Analytical Biochemistry,2004,329(2):324-333.

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