豬源大腸桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥性及耐藥基因檢測

晏云濤 俸江琴 趙汝

摘要：為調查云南大理某地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對鏈霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、阿米卡星和慶大霉素的耐藥性，并獲悉氨基糖苷類2個耐藥基因strA、strB的攜帶情況，試驗采用抗菌藥物敏感試驗紙片法探究55株大腸桿菌對6種氨基糖苷類藥物的耐藥性，通過常規(guī)PCR檢測strA、strB攜帶率。結果表明，鏈霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、阿米卡星和慶大霉素的耐藥率依次為50.9%、40.0%、30.9%、43.6%、12.7%、41.8%。strA、strB檢出率分別為76.4%和72.7%，同時含有2種耐藥基因的頻率高達50.9%，說明云南大理受檢地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥情況嚴重。

關鍵詞：豬源致病性大腸桿菌;耐藥性;耐藥基因;氨基糖苷;聚合酶鏈式反應

中圖分類號：S858.282.61+2?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0222-03

大腸桿菌（Escherichia coli）是腸桿菌科細菌的模式種，是在特定條件下可引起人畜共患病的一種病原菌，是在養(yǎng)豬業(yè)中最常見的病原菌之一。大腸桿菌可引起敗血癥、水腫病、新生仔豬腹水和仔豬黃白痢等多種疾病，并且具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。

為避免大腸桿菌病的產生，農戶與豬場通常會把氨基糖苷類藥物加入飼料中飼喂畜禽[2]，以便對各種大腸桿菌疾病進行預防和控制，但隨著抗菌藥物的廣泛應用和在疾病治療中的不當使用，常導致豬場環(huán)境中大腸桿菌耐藥菌株產生，對氨基糖苷類藥物的耐藥性發(fā)生變化[3-4]。大腸桿菌耐藥菌株對氨基糖苷類的耐藥機制主要有3種：一是細胞內膜轉運異常使藥物在細菌體內的蓄積減少或者細菌外膜蛋白通透性發(fā)生改變;二是出現氨基糖苷類鈍化酶;三是藥物作用靶位改變[5-6]，使藥物進入細菌后不可以有效地與核糖體結合而產生耐藥性。楊慧等發(fā)現，飼料中添加銅鹽導致豬銅抗性基因的產生，同時協(xié)同選擇了氨基糖苷類藥物strA、strB耐藥基因的產生[7]。這些認識有利于對云南大理豬源致病性大腸桿菌耐藥性、耐藥基因進行研究。

本試驗采用筆者所在實驗室分離保存的云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌進行6種氨基糖苷類抗生素耐藥性檢測，strA和strB屬于編碼磷酸轉移酶的基因，用來編碼修飾鏈霉素鈍化基因，對耐藥基因進行PCR擴增，獲悉其耐藥性與耐藥基因關系，以明確云南大理被檢測區(qū)豬源致病性大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥情況，旨在為今后的獸醫(yī)臨床用藥提供參考，為豬源致病性大腸桿菌在畜禽體內的抗逆機制和耐藥機制研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院病理實驗室保存的55株，于2017年6月從云南省大理市部分豬場腹泄仔豬糞便中分離純化好的豬源致病性大腸桿菌。

1.2 主要試劑

藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司;細菌DNA提取試劑盒，購自北京百泰克生物技術有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他試劑，均為實驗室常規(guī)試劑。

1.3 藥敏試驗

選用抗菌藥物敏感試驗紙片法對6種氨基糖苷類藥物（鏈霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素和阿米卡星）進行藥敏試驗。藥敏試驗判斷標準參見美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）所推薦的抗菌藥物敏感試驗紙片法[8]。

1.4 細菌基因組DNA的提取

按照細菌DNA提取試劑盒說明書中方法進行細菌基因組DNA的提取，最后溶于40 μL TE緩沖液中備用。

1.5 PCR擴增

參照文獻[9]，在GenBank上，找到序列并下載序列，用Prmier 5.0引物設計軟件設計相應引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及信息見表1。

PCR反應體系見表2。

PCR反應程序：95 ℃ 3.0 min;94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，30個循環(huán);72 ℃10 min。在1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，結果在紫外燈下觀察并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照記錄保存。

2 結果和分析

2.1 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表3、圖1）顯示，分離純化后的55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對鏈霉素的耐藥率最高，達50.9%，其次是妥布霉素（43.6%）、慶大霉素（41.8%）、卡那霉素（40.0%）、新霉素 （30.9%），耐藥率最低的是阿米卡星（12.7%）。

2.2 耐藥基因檢測結果

2.2.1 目的基因strA擴增結果 由圖2可知，在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中出現42株陽性菌株，strA陽性率為76.4%，所得條帶片段大小為197 bp。

2.2.2 目的基因strB擴增結果 由圖3可知，在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中出現40株陽性菌株，strB陽性率為72.7%，所得條帶片段大小為326 bp。

3 討論

展天松等對江蘇地區(qū)大腸桿菌耐藥性分析結果顯示，對阿米卡星耐藥率最低，僅為15.7%，對鏈霉素耐藥率最高為 62.9%[10]，與本研究結果大致相同，原因可能是鏈霉素價格較為低廉，抗菌譜廣，眾多農戶長期大量使用此類藥物預防和治療疾病。朱永江等對40株畜禽大腸桿菌常用氨基糖苷類抗生素進行藥敏試驗，結果顯示，對卡那霉素耐藥率高達57.5%[11]，與本試驗結果存在較大出入，產生此種現象原因可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖模式和預防觀念不同，也可能與研究基數有關，或與地區(qū)用藥差異有關，相關影響因素還需進一步調查。

金文杰等在對216株大腸桿菌進行檢測時，檢測到編碼修飾鏈霉素的鈍化酶基因strA的陽性率為56%，strB的陽性率為65.7%[12]。本試驗中， 在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中strA陽性率為 76.4%，strB陽性率為72.7%，其中有28株菌株同時存在strA和strB耐藥基因，占 50.9%，表明豬源致病性大腸桿菌普遍攜帶耐藥基因strA和strB，進一步說明大腸桿菌的耐藥性和耐藥基因存在關系。

云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥特性有所改變，在用藥時需選有效藥。其中，合理用藥是關鍵，合理選擇用藥，具體為開發(fā)新藥、使用以耐萬古霉素腸球菌（VRE）[13]和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[14]為靶點的新抗生素和發(fā)展生物制劑;目前，已知黃連、金銀花、艾葉、五倍子4類中藥水提物對大腸桿菌表現出明顯的抑菌效果[15]，尋找安全有效治療豬大腸桿菌病的藥物是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的關鍵問題。耐藥性的差異可為畜場合理選用獸藥提供依據，掌握不同時期大腸桿菌的耐藥情況，便于防控大腸桿菌疾病，以選擇合理的方案進行用藥?？咕幬锏拇罅渴褂茫辜毦菀鬃园l(fā)突變，加快耐藥性傳播和擴散。不同豬場大腸桿菌可能存在不同的耐藥譜和耐藥率，獸醫(yī)臨床應根據本場病原菌的藥敏特征正確選用合適的防治藥物。

4 結論

55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對6種氨基糖苷類抗生素存在不同程度的耐藥率，使這6種氨基糖苷類藥物不能完全有效發(fā)揮作用，其中對鏈霉素耐藥率最高，達到50.9%，且檢測到編碼修飾鏈霉素的鈍化酶基因strA陽性率為76.4%，strB陽性率為72.7%，充分說明耐藥基因與耐藥表型具有一定相關性。大腸桿菌耐藥性的普遍存在對畜牧業(yè)具有一定的影響，需要進一步控制。只有抑制耐藥性的產生、阻斷耐藥機制的形成，才能真正地防治云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌疾病。

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