3株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病致病菌的藥劑室內(nèi)毒力比較

王瑞 雷霽卿 查仕連

摘要：為了篩選獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的有效防治藥劑，采用抑菌圈法比較28種殺菌劑對(duì)不同獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病3株致病菌（PSA1、PSA2、PSA3）的室內(nèi)毒力，并測(cè)定藥劑間復(fù)配對(duì)致病菌的聯(lián)合毒力。結(jié)果表明，28種殺菌劑中20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清3種殺菌劑對(duì)PSA1的毒力效果較強(qiáng)，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對(duì)照藥劑72%硫酸鏈霉素（對(duì)PSA1的毒力效果EC50值分別為44.56、54.56、77.82 mg/L）的毒力效果;而40%百菌清對(duì)PSA2和PSA3表現(xiàn)出較好的毒力作用，其EC50值分別為53.21、54.45 mg/L，優(yōu)于對(duì)照藥劑硫酸鏈霉素。不同比例復(fù)配藥劑的室內(nèi)毒力篩選發(fā)現(xiàn)，20%溴硝醇+20%葉枯唑（質(zhì)量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質(zhì)量比為3 ∶ 1）2種復(fù)配劑對(duì)PSA1表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒力，且為增效作用，均可作為田間獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的有效防控藥劑。

關(guān)鍵詞：獼猴桃;潰瘍病;殺菌劑;毒力測(cè)試;聯(lián)合毒力

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0141-03

獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生藤木植物，別稱(chēng)毛桃、羊桃、奇異果（Kiwifruit）[1]，其果實(shí)含有大量的維生素、黃體素、氨基酸和天然肌醇，素有“水果之王”的美譽(yù);此外，獼猴桃的根具有清熱解毒、活血散結(jié)、祛風(fēng)利濕等功效[2]。近年來(lái)，世界范圍獼猴桃產(chǎn)業(yè)得到了持續(xù)發(fā)展，種植面積逐年增加，然而隨著生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，管理不科學(xué)，導(dǎo)致獼猴桃病害問(wèn)題日益突出，其中獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是一種嚴(yán)重威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病害，已成為制約獼猴桃產(chǎn)量的毀滅性因素，該病害的致病菌已確認(rèn)為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidia）[3-8]，其主要危害獼猴桃樹(shù)的枝干、葉片和花，枝干受害后形成黃褐色或銹紅色的局部潰瘍腐爛，影響?zhàn)B分的輸送和吸收，造成樹(shù)勢(shì)衰弱，嚴(yán)重時(shí)可環(huán)繞莖桿引起樹(shù)體死亡。因此，對(duì)獼猴桃潰瘍病的防控進(jìn)行深入研究，尋求有效的病害防控藥劑和方法是獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保障。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于該病害的藥劑防治主要依賴于銅制劑和農(nóng)用鏈霉素，長(zhǎng)期單一使用該類(lèi)藥劑易使病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抗藥性，從而導(dǎo)致防治效果下降[9]。采用合理的化學(xué)藥劑復(fù)配使用既可以提高防效、擴(kuò)大防治譜的效果，又可以有效延緩病原菌的抗藥性，同時(shí)還可以降低田間病害的防控成本[10]。針對(duì)這一目的，筆者所在課題組前期發(fā)現(xiàn)乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅3種農(nóng)藥在室內(nèi)毒力和田間防治中效果較好[11-12]。為了篩選出更好的獼猴桃潰瘍病致病菌防控藥劑，在前期工作的基礎(chǔ)上，本研究分別從貴州省貴陽(yáng)市修文縣1個(gè)貴長(zhǎng)獼猴桃果園、貴州省貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)偏坡鄉(xiāng)2個(gè)紅陽(yáng)獼猴桃果園獼猴桃植株患處分離、純化獲得3株丁香假單胞桿菌屬菌株，同時(shí)篩選了28種抗菌劑單劑對(duì)3株致病菌的室內(nèi)毒力，并篩選了不同比例復(fù)配藥劑的室內(nèi)毒力，為獼猴桃種植業(yè)中潰瘍病的綜合防控提供長(zhǎng)效、高效藥劑基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 參照文獻(xiàn)[13-14]的方法，于2016年3—4月分別從修文縣谷堡鄉(xiāng)1個(gè)貴長(zhǎng)獼猴桃果園、貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)偏坡鄉(xiāng)2個(gè)紅陽(yáng)獼猴桃果園采集感病植株染病部位，于貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室采用稀釋劃線法，分離純化得到潰瘍病發(fā)病部位細(xì)菌，經(jīng)菌落PCR、美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫(kù)Blast比對(duì)，獲得高同源性序列，分別與Pseudomonas sp. J3.1C9、Pseudomonas sp. SR64、Pseudomonas sp. WXBSY5同源性達(dá)99%，3株菌種屬于均丁香假單胞桿菌屬，分別命名為PSA1、PSA2、PSA3。

1.1.2 供試藥劑 20%溴硝醇可濕性粉劑（丹東市農(nóng)藥總廠）;20%葉枯唑粉劑（山東拜耳化工有限公司）;80%多菌靈粉劑（英國(guó)邦農(nóng)達(dá)農(nóng)用化學(xué)品有限公司）;40%己唑醇懸浮劑（西安北農(nóng)華農(nóng)作物保護(hù)有限公司）;75%抑霉唑硫酸鹽粒劑、50%克菌丹粉劑（安道麥馬克西姆有限公司）;3%甲霜·霉靈水劑（天津市綠亨化工有限公司）;50%異菌脲粉劑[富美實(shí)（中國(guó)）投資有限公司];20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）、50%氯溴異氰尿酸粉劑（南京南農(nóng)農(nóng)藥科技發(fā)展有限公司）;60%唑醚·代森聯(lián)散粒劑、60%唑醚·代森聯(lián)散粒劑（青島奧迪斯生物科技有限公司）;75%三環(huán)唑粉劑（上海銳聯(lián)化工有限公司）;12.5%四氟醚唑水乳劑、70%甲基硫菌靈粉劑、41%甲硫戊唑醇懸浮劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司）;80%代森錳鋅粉劑（美國(guó)陶氏益農(nóng)公司）;50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（江蘇省蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司）;37%苯醚甲環(huán)唑散粒劑（山東海訊生物化學(xué)有限公司）;80%烯酰嗎啉散粒劑（江西禾益化工股份有限公司）;70%氟環(huán)唑散粒劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑、60%嘧菌酯散粒劑（北京華戎生物激素廠）;50%硫磺·多菌靈粉劑（江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司）;26%嘧胺·乙霉威散粒劑（青島瀚生生物科技股份有限公司）;40%百菌清懸?。ㄈ毡緳M濱工廠）;5%烯效唑粉劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）;3%噻霉酮粉劑（陜西西大華特科技實(shí)業(yè)有限公司）;對(duì)照藥劑為72%硫酸鏈霉素（四川長(zhǎng)征普惠生物工程有限公司）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH值為6.8～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑處理 首先將28種藥劑配制成1 000 mg/L的藥液進(jìn)行初篩，對(duì)于毒力較好的單劑和復(fù)配制劑均設(shè)置 1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L 6個(gè)濃度梯度（以有效成分計(jì)），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，另設(shè)清水為空白對(duì)照，農(nóng)用鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)[11，15]的方法，采用抑菌圈法測(cè)定28種單劑、復(fù)配劑對(duì)3株丁香假單胞桿菌的室內(nèi)毒力。用無(wú)菌水配制含病原菌細(xì)胞106～107個(gè)/mL的菌懸液，每皿加入菌懸液1.0 mL，倒入至約10 mL、28 ℃的NA培養(yǎng)基，搖勻后制成平板。將直徑為6 mm的滅菌濾紙片放入各藥液內(nèi)浸泡1 h，取出，放入平皿中，以無(wú)菌水浸泡濾紙為對(duì)照（CK），農(nóng)用鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照，置于28 ℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。48 h后觀察，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率，并以藥劑濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作回歸方程，得到各藥劑對(duì)獼猴桃潰瘍致病菌的抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 毒力指數(shù)及混劑共毒系數(shù)的計(jì)算 根據(jù)文獻(xiàn)提出的方法[16-17]，選定試驗(yàn)中的一種農(nóng)藥為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出其余農(nóng)藥單用或混用的毒力指數(shù)（設(shè)其標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的毒力指數(shù)為100，毒力指數(shù)越大毒力越強(qiáng)）。

供試藥劑的毒力指數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50供試藥劑的EC50×100%;

混劑共毒系數(shù)=混劑實(shí)際毒力指數(shù)混劑理論毒力指數(shù)×100%;

混劑實(shí)力毒力指數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50混劑的EC50×100%。

混劑理論毒力指數(shù)=各單劑的毒力指數(shù)與其在混劑中含量的積的總和，共毒系數(shù)大于100為增效作用，等于100為相加作用，小于100為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑的室內(nèi)毒力

通過(guò)初步活性篩選，在濃度為1 000 mg/L的藥液濃度下，28種供試藥劑中有16種藥劑對(duì)PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假單胞桿菌致病菌表現(xiàn)出抑菌作用，其中包括20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清、3%甲霜·霉靈、3%噻霉酮、50%異菌脲、80%代森錳鋅、40%己唑醇、50%克菌丹、20%噻菌銅、50%氯溴異氰尿酸、60%唑醚·代森聯(lián)、80%多菌靈、70%甲基硫菌靈、5%烯效唑、75%三環(huán)唑;而50%咪鮮胺錳鹽、37%苯醚甲環(huán)唑、80%烯酰嗎啉、75%抑霉唑硫酸鹽、60%嘧菌酯、50%硫磺·多菌靈、26%嘧胺·乙霉威、430 g/L戊唑醇、12.5%四氟醚唑、41%甲硫戊唑醇、70%氟環(huán)唑散粒劑、60%唑醚·代森聯(lián)12種抗菌劑對(duì)PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假單胞桿菌致病菌均未顯現(xiàn)出抑菌作用。由表1可知，20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清3種殺菌劑對(duì)PSA1的毒力效果較強(qiáng)，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對(duì)照藥劑72%硫酸鏈霉素（其對(duì)PSA1的毒力效果EC50值為44.56 mg/L）;而40%百菌清對(duì)PSA2和PSA3表現(xiàn)出較好的毒力作用，其EC50值分別為53.21、54.45 mg/L，優(yōu)于對(duì)照藥劑硫酸鏈霉素;其他藥劑對(duì)PSA1、PSA2和PSA3的毒力效果EC50值均大于對(duì)照藥劑，僅表現(xiàn)出較弱的毒力活性。

2.2 藥劑復(fù)配的室內(nèi)毒力

為了篩選出較理想的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病防控藥劑，測(cè)定20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清不同復(fù)配比例藥劑對(duì)PSA1的聯(lián)合毒力，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清不同比例復(fù)配劑對(duì)PSA1的聯(lián)合毒力存在較明顯的差異，其中20%溴硝醇+20%葉枯唑（質(zhì)量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質(zhì)量比為3 ∶ 1）2種復(fù)配劑對(duì)PSA1的共毒系數(shù)較大，分別為159.31、173.50，表現(xiàn)出較好的增效作用;而20%溴硝醇+40%百菌清（質(zhì)量比為1 ∶ 3）和20%葉枯唑+40%百菌清（質(zhì)量比為1 ∶ 1）2種復(fù)配劑對(duì)PSA1表現(xiàn)出拮抗作用，其共毒系數(shù)分別為92.62、80.40;其余復(fù)配劑表現(xiàn)出加和作用，共毒系數(shù)大約為100。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以3株丁香假單胞桿菌屬菌種PSA1、PSA2和PSA3為對(duì)象，采用抑菌圈法對(duì)28種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力比較，發(fā)現(xiàn)20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清對(duì)PSA1、PSA2和PSA3 3株致病菌表現(xiàn)出較好的毒力作用，其中20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清對(duì)PSA1的毒力效果較強(qiáng)，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對(duì)照藥劑72%硫酸鏈霉素。進(jìn)一步的復(fù)配藥劑篩選發(fā)現(xiàn)20%溴硝 醇+20%葉枯唑（質(zhì)量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質(zhì)量比為3 ∶ 1）2種復(fù)配劑對(duì)PSA1表現(xiàn)出較好的毒力效果，且表現(xiàn)出明顯的增效作用。本研究為后續(xù)田間防控試驗(yàn)提供了重要藥劑，有望在田間的實(shí)際應(yīng)用中替代硫酸鏈霉素。由于田間發(fā)病的因素較為復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果[18]，本試驗(yàn)僅在室內(nèi)篩選得到了較理想的防治藥劑，但仍需通過(guò)田間試驗(yàn)得以證明，最終為貴陽(yáng)市修文縣、烏當(dāng)區(qū)乃至貴州省獼猴桃大規(guī)模種植中心區(qū)獼猴桃潰瘍病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

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