小麥成熟胚再生體系優(yōu)化效果評價及高再生率基因型篩選

吳曉軍 胡喜貴 陳向東

摘要：為了對小麥成熟胚的再生優(yōu)化體系進行培養(yǎng)效果評價及篩選高再生率基因型，以7個小麥品種成熟胚為材料，采用常規(guī)和優(yōu)化2種培養(yǎng)基體系，研究3種胚處理方式對成熟胚出愈率、分化率及再生率的影響。結(jié)果表明：優(yōu)化培養(yǎng)基體系組織培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)基體系;胚處理方式與基因型之間可能存在一定的互作關(guān)系，特定基因型品種采用不同胚處理方法，其組織培養(yǎng)效果差異明顯，且不同品種的最適胚處理方式可能不同。在供試的7個品種中，矮抗58、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160和周麥22在經(jīng)完整胚法處理，分化率均達到50%以上，再生率均達到25%以上，其中以矮抗58和百農(nóng)160最優(yōu)，再生率分別達到51.74%、43.84%。而采用縱半切略帶胚乳法時，寶豐7228和中麥175的分化率和再生率均較完整胚法有了較大提升，分別達到62.89%、56.79%和26.88%、36.75%。說明特定基因型品種須要找到最適合的胚處理方法，以充分挖掘其再生能力，獲得的高再生率小麥品種可用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。

關(guān)鍵詞：小麥;成熟胚;基因型;再生體系;再生率;分化率

中圖分類號： S512.103? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0074-04

小麥是世界主要糧食及飼料作物之一，不斷改善小麥營養(yǎng)品質(zhì)和提高產(chǎn)量潛力始終是小麥遺傳改良的中心任務(wù)，而相關(guān)有利基因的發(fā)掘和利用是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，隨著小麥全基因組序列的公布，大量基因被挖掘出來，迫切須要進行功能鑒定和利用研究。因此，建立穩(wěn)定高效的組織培養(yǎng)再生體系將會極大地推進小麥功能基因組學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化研究。

不同外植體對組織培養(yǎng)再生有很大影響，目前小麥幼穗、盾片、幼葉、根尖分生組織、花藥、幼胚、成熟胚等都被成功應(yīng)用于小麥組織培養(yǎng)中[1-2]，其中小麥幼胚是最常用的外植體，它具有操作簡單、愈傷誘導(dǎo)及植株再生能力強的特點，被認為是最為理想的組織培養(yǎng)材料，然而小麥幼胚的獲得受時間、空間和季節(jié)條件的限制，并且難以判斷籽粒發(fā)育階段是否一致;另外，小麥幼胚周年利用須要使用人工氣候室，建造和維持成本較高，這在一定程度上限制了幼胚在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[3]。而小麥成熟胚具有發(fā)育狀態(tài)一致、不受季節(jié)限制、可以大量獲取的優(yōu)點，是進行小麥遺傳轉(zhuǎn)化最為方便利用的受體材料。

目前，對小麥成熟胚的組織培養(yǎng)研究主要集中于種子預(yù)處理溫度[4-5]、胚切割接種方式[1，6-9]、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分[10-12]、外源激素種類及濃度配比[13-14]等方面，獲得了一些研究進展。然而，成熟胚愈傷組織的分化率普遍低于幼胚，能夠用于遺傳轉(zhuǎn)化研究的小麥基因型還很少，這些仍然是小麥成熟胚組織培養(yǎng)需要解決的主要問題。本研究以7個小麥品種為材料，在優(yōu)化再生體系的基礎(chǔ)上，探討成熟胚切割方式對不同基因型小麥植株再生的影響，篩選其中的高再生率基因型，以期為建立穩(wěn)定高效的小麥成熟胚組織培養(yǎng)再生體系提供一些科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年6—11月在河南科技學(xué)院內(nèi)進行。供試材料為近年來適宜黃淮麥區(qū)種植的7個優(yōu)良小麥品種，包括百農(nóng)矮抗58、周麥22、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160、中麥175、和寶豐7228，均由河南科技學(xué)院雜交小麥工程中心提供。

本研究使用2套培養(yǎng)基體系。一是常規(guī)培養(yǎng)基體系，包括誘導(dǎo)（MSI）、繼代（MSS）、分化（MSD）、生根（MSR） 4種培養(yǎng)基，主要以MS為基本成分，輔加500 mg/L水解酪蛋白。MSI培養(yǎng)基，MS+500 mg/L 水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂，pH 值為5.8;MSS培養(yǎng)基，MS+500 mg/L 水解酪蛋白+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂，pH值為5.8;MSD培養(yǎng)基，MS+500 mg/L 水解酪蛋白+2 mg/L KT+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂，pH值為5.8;MSR培養(yǎng)基，1/2MS+20 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂，pH值為5.8。

一是優(yōu)化培養(yǎng)基體系，包括Adi誘導(dǎo)培養(yǎng)基[12]、繼代（SM）培養(yǎng)基、分化（DM）培養(yǎng)基、生根（RM）培養(yǎng)基。Adi誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS（不含維生素）+2 mg/L 2，4-D+5 mg/L谷氨酰胺+0.5 g/L水解酪蛋白+15 g/L山梨醇+15 g/L甘露醇+0.75 g/L MgCl2+維生素 B5（10 mg/L維生素B1+1 mg/L 維生素B6+1 g/L維生素B3）+2 mg/L甘氨酸+4 mg/L 硝酸銀+40 mg/L半胱氨酸+100 mg/L維生素C+39 mg/L 乙酰丁香酮+20 g/L葡萄糖+7 g/L 瓊脂粉，pH值為5.8;SM培養(yǎng)基，MS（不含維生素）+2 mg/L 2，4-D+2 mg/L 甘氨酸+0.5 mg/L維生素B1+0.25 mg/L維生素 B6+0.25 mg/L維生素B3+100 mg/L肌醇+20 g/L蔗糖+4 mg/L 硝酸銀+ 7 g/L 瓊脂粉，pH值為5.8;DM培養(yǎng)基，MS（不含維生素）+5 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L維生素B1+0.25 mg/L維生素B6+0.25 mg/L維生素B3+2 mg/L 甘氨酸+100 mg/L肌醇+4 mg/L硝酸銀+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，pH值為5.8;RM培養(yǎng)基，1/2MS（不含維生素）+0.5 mg/L多效唑（MET）+0.2 mg/L IAA+0.5 mg/L維生素B1+0.25 mg/L維生素B6+0.25 mg/L維生素B3+1 mg/L甘氨酸+50 mg/L肌醇+20 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂粉，pH值為5.8。

1.2 種子滅菌及組織培養(yǎng)方法

選取外觀健康、籽粒飽滿、大小一致、當(dāng)年收獲的小麥種子，在實驗室自來水下沖洗干凈，加入70%乙醇處理1 min、滅菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞處理5 min，無菌水沖洗4～5次，處理完畢后加入適量無菌水，用封口膜封口，過夜浸泡15～20 h。次日，在超凈臺上用70%乙醇處理1 min、滅菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞處理5 min，無菌水沖洗4～5次，放置于存有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)備用。

剝胚處理采用3種方法：（1）完整胚法。用鑷子和解剖刀剝?nèi)⊥暾?，盾片向上接種。（2）縱半切略帶胚乳。先沿胚軸切約1/2，取胚時帶一小塊胚乳，盾片向上接種。（3）成熟胚刮碎法。使用解剖刀將成熟胚刮碎接種。

本研究使用常規(guī)培養(yǎng)基體系和優(yōu)化培養(yǎng)基體系，將胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MSI或Adi）上，在25 ℃條件下，暗培養(yǎng) 10 d 誘導(dǎo)愈傷，然后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MSS或SM）上培養(yǎng)2周（12 h光照/12 h黑暗，25 ℃），挑選淡黃色、致密的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MSD或DM）上（14 h光照/10 h黑暗，25 ℃），2周繼代1次，待分化成苗后轉(zhuǎn)移至生根壯苗培養(yǎng)基（MSR或RM）上進行生根培養(yǎng)。

本研究首先對4、25 ℃下小麥種子預(yù)處理再生效果進行評價，具體是將周麥22、百農(nóng)矮抗58各接種150粒于常規(guī)培養(yǎng)基體系進行培養(yǎng)，試驗結(jié)果確定4 ℃過夜浸泡處理效果較好。后續(xù)試驗均在4 ℃下進行小麥種子預(yù)處理，每個處理接種60個左右的成熟胚，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計分析方法

試驗采用3種剝胚處理方法，各品種每個處理接種3瓶，每瓶約20個成熟胚，設(shè)置3個重復(fù)。使用DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理，方差分析采用Turkey檢驗。3個統(tǒng)計項目出愈率、分化率和再生率的計算方法如下：

出愈率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

分化率=分化綠芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;

再生率=再生苗數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸種溫度和不同胚處理方式對愈傷誘導(dǎo)及分化的影響

以小麥品種矮抗58和周麥22成熟胚為材料，采用常規(guī)培養(yǎng)基體系進行培養(yǎng)，研究并驗證不同浸種溫度、不同胚處理方式對小麥成熟胚再生培養(yǎng)的影響。

2個品種在4、25 ℃下進行預(yù)處理，取完整胚進行接種培養(yǎng)，結(jié)果（表1、圖1）顯示，經(jīng)4 ℃預(yù)處理后，2個品種的出愈率和分化率均高于25 ℃預(yù)處理。再將2個品種種子進行 4 ℃ 過夜浸泡，采用完整胚法、縱半切略帶胚乳法和成熟胚刮碎法處理，再生培養(yǎng)結(jié)果顯示，縱半切略帶胚乳法的愈傷誘導(dǎo)率和分化率均略高于完整胚法，成熟胚刮碎法最低（表2）?？梢钥闯觯诔Ｒ?guī)培養(yǎng)基體系，小麥種子經(jīng)4 ℃預(yù)處理 15～20 h，采用縱半切略帶胚乳法取胚是最優(yōu)培養(yǎng)方法。然而，2個品種的分化率都還較低，并無法滿足成熟胚再生培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究的需要。

2.2 小麥成熟胚再生體系優(yōu)化和優(yōu)良基因型的篩選

為了進一步探索更適于小麥成熟胚組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基體系、接種前胚處理方法及篩選高再生率小麥基因型，本研究采用改進的優(yōu)化培養(yǎng)基體系，以矮抗58、周麥22、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160、中麥175、和寶豐7228 7個小麥品種為材料，進行3種胚處理方式下的再生培養(yǎng)效果和影響研究，以期為建立高效廣適的小麥成熟胚再生體系提供參考。

研究結(jié)果（表3、圖1）顯示，除中麥175（完整胚法）、百農(nóng)419（縱半切略帶胚乳法）和百農(nóng)160（成熟胚刮碎法）出愈率較低外， 其他品種的出愈率均在85%以上。在不同胚處理方法下，7個品種分化率為34.97%～80.11%，其中矮抗58采用完整胚法時最高，為80.11%。除百農(nóng)160（縱半切略帶胚乳法）及矮抗58、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160、周麥22（成熟胚刮碎法）再生率較低外，其他品種的再生率均在20%以上，其中矮抗58最高，達51.74%。此外，采用常規(guī)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)，矮抗58和周麥22的出愈率無明顯差異，均達到90%以上;而與常規(guī)培養(yǎng)基相比，分化率在優(yōu)化培養(yǎng)基中獲得較大提高，提高幅度分別達到71.22%和26.79%（完整胚法）、 45.52%和33.29%（縱半切略帶胚乳法）、 45.12%和27.19%（成熟胚刮碎法）。綜合以上結(jié)果表明，小麥成熟胚基于優(yōu)化培養(yǎng)基體系的再生培養(yǎng)效果全面優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)基體系，且優(yōu)化培養(yǎng)基體系對大多數(shù)小麥基因型的再生培養(yǎng)具有相對較好的通用性。

本研究中各處理內(nèi)部進行了方差齊性檢驗，結(jié)果顯示，P值均大于0.05，可進行方差分析。由表3可以看出，7個品種的平均出愈率在不同胚處理方式間差異并不顯著;完整胚法的平均分化率、平均再生率均與成熟胚刮碎法差異達到顯著水平，縱半切略帶胚乳法與其他2種胚處理方法差異均不顯著。綜合分析表明，7個品種的平均出愈率、分化率及再生率為完整胚法>縱半切略帶胚乳法>成熟胚刮碎法;不同小麥基因型的最適胚處理方式可能不同，具體來說，矮抗58、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160和周麥22適于采用完整胚法處理，中麥175和寶豐7228適于采用縱半切略帶胚乳法處理;成熟胚刮碎法還須進一步摸索再生培養(yǎng)條件和影響因素。

3 討論與結(jié)論

目前，小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究中成功應(yīng)用且農(nóng)藝性狀較優(yōu)的受體材料相對較少，育種利用較為困難，因此，在生產(chǎn)推廣品種中篩選同時具有高再生能力和優(yōu)良農(nóng)藝性狀的小麥基因型具有重要價值。

當(dāng)年收獲的小麥經(jīng)脫粒曬干后，其成熟胚與胚乳結(jié)合緊密且較為干癟，剝?nèi)±щy，一般都須采取過夜浸種處理，這個過程中種子吸水膨脹、從休眠狀態(tài)恢復(fù)到生長狀態(tài)。栗聰?shù)仍?、25 ℃溫度下對小麥種子分別進行6、25 h浸種處理，結(jié)果顯示接種前4 ℃處理15 h再生效果最佳[15]。李映輝等在4 ℃溫度下對小麥進行了4個時間水平（0、12、24、48 h）的浸種處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)12、24 h低溫處理的小麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷再生效果最好[9]。本研究的結(jié)果與上述研究一致，經(jīng) 4 ℃ 過夜處理15～20 h的小麥品種比25 ℃處理有更好的誘導(dǎo)再生效果。但也有研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)浸泡的干種子剝胚接種后的再生效果優(yōu)于浸泡過的種子[10]。因此，作為建立高效誘導(dǎo)再生體系的一個環(huán)節(jié)，有必要進一步擴大樣本量，對干種子直接剝胚與低溫浸泡處理的誘導(dǎo)再生效果進行評價和比較，明確成熟胚的最佳預(yù)處理方式。

培養(yǎng)基提供外植體材料再生所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有滲透調(diào)節(jié)和支撐作用。為了進一步提高再生培養(yǎng)效率，對培養(yǎng)基中的成分進行優(yōu)化十分必要。本研究中使用了2套培養(yǎng)基體系，在成分組成上具有較大差異。優(yōu)化培養(yǎng)基體系中的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Adi培養(yǎng)基[12]，與原培養(yǎng)基成分相比，筆者用2，4-D替換麥草畏（Dicamba）以降低培養(yǎng)基成本。在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加AgNO3，Ag+具有抑制乙烯對多胺合成的干擾作用，能夠間接促進多胺的合成積累，改善愈傷褐化情況，提高植物再生效率[16]。一些研究表明，在組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+等金屬離子對小麥愈傷組織分化發(fā)生具有積極的正向作用[17-18]。

在小麥成熟胚再生體系完善過程中，胚處理方式是一個重要的研究內(nèi)容。最初的研究多采用完整胚法進行接種，植株再生頻率較低[19]。于是研究者們逐漸發(fā)展出成熟胚切割接種[6，11]、胚乳支撐接種[1，4]、成熟胚刮碎[5，20]等方法，獲得了較完整胚接種法更好的組織培養(yǎng)效果。小麥基因型是影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生的重要內(nèi)在因素之一。Henry等的研究表明，小麥愈傷組織再生能力是受多個基因調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀[21]。zgen等的研究認為，胚性愈傷率、分化率和再生率受到基因型的影響[22]。本研究的結(jié)果顯示，基于相同培養(yǎng)，不同基因型小麥品種的出愈率一般差異不明顯，而分化率、再生率品種之間可能差異顯著;在某一特定胚處理方式下分化率、再生率表現(xiàn)較好的品種，采用另一種胚處理方式的再生培養(yǎng)效果可能表現(xiàn)一般，存在胚處理方式與基因型的互作現(xiàn)象。如本試驗中矮抗58、濟麥22、百農(nóng)419、百農(nóng)160和周麥22采用完整胚法時表現(xiàn)較好，分化率達到50%以上，而中麥175和寶豐7228表現(xiàn)一般;采用縱半切略帶胚乳法時，中麥175和寶豐7228的分化率、再生率較完整胚法均有較大提升，表現(xiàn)較好。因此，本研究認為，基因型是影響成熟胚再生能力的主要因素之一，但胚處理方式與基因型之間可能存在著一定的互作關(guān)系，對特定基因型品種須要進行多種胚處理方式下的再生效果評價，找到最適合的胚處理方法，以將基因型的再生能力最大化，這為遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了更多的受體材料，進一步促進小麥遺傳育種研究。

參考文獻：

[1]zgen M，Türet M，Altnok S，et al. Efficient callus induction and plant regeneration from mature embryo culture of winter wheat（Triticum aestivum L.）genotypes[J]. Plant Cell Reports，1998，18（3/4）：331-335.

[2]Mendoza M G，Kaeppler H F. Auxin and sugar effects on callus induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of wheat（Triticum aestivum L.）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology（Plant），2002，38（1）：39-45.

[3]Birsin M A，Ozgen M. A comparison of callus induction and plant regeneration from different embryo explants of triticale （Xtriticosecale Wittmack）[J]. Cellular & Molecular Biology Letters，2004，9（2）：353-361.

[4]zgen M，Türet M，zcan S，et al. Callus induction and plant regeneration from immature and mature embryos of winter durum wheat genotypes[J]. Plant Breeding，1996，115（6）：455-458.

[5]Ding L P，Li S C，Gao J M，et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation conditions in mature embryos of elite wheat[J]. Molecular Biology Reports，2009，36（1）：29-36.

[6]Delporte F，Mostade O，Jacquemin J M. Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2001，67（1）：73-80.

[7]陳軍營，尹海燕，梁靜靜，等. 不同預(yù)處理對小麥成熟胚愈傷組織形成的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，34（1）：19-21.

[8]廖祥儒，郭中偉，杜建芳，等. 低溫和PEG預(yù)處理對小麥愈傷組織形成及IAA氧化的影響[J]. 植物學(xué)通報，2000，17（3）：257-259.

[9]李映輝，宋 娜，王瑜暉，等. 小麥成熟胚培養(yǎng)方法的優(yōu)化及其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J]. 麥類作物學(xué)報，2013，33（1）：6-12.

[10]Yu Y，Wang J，Zhu M L，et al. Optimization of mature embryo-based high frequency callus induction and plant regeneration from elite wheat cultivars grown in China[J]. Plant Breeding，2008，127（3）：249-255.

[11]Zale J M，Borchardt-Wier H，Kidwell K K，et al. Callus induction and plant regeneration from mature embryos of a diverse set of wheat genotypes[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2004，76（3）：277-281.

[12]Yin G X，Wang Y L，She M Y，et al. Establishment of a highly efficient regeneration system for the mature embryo culture of wheat[J]. Agricultural Sciences in China，2011，10（1）：9-17.

[13]Filippov M，Miroshnichenko D，Vernikovskaya D，et al. The effect of auxins，time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of wheat[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2006，84（2）：213-222.

[14]張 偉. 小麥組織培養(yǎng)再生體系及單倍體植株誘導(dǎo)技術(shù)優(yōu)化研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[15]栗 聰，雒景吾，張 磊，等. 小麥成熟胚再生體系優(yōu)化及優(yōu)良受體基因型篩選[J]. 麥類作物學(xué)報，2014，34（5）：583-590.

[16]Zhang P，F(xiàn)u A G，Wang A G. Role and possible mechanism of AgNO3 in plant culture in vitro[J]. Plant Physiology Communications，1997，35（5）：376-379.

[17]楊 筱，孟亞雄，馬小樂，等. CuSO4和EDTA-Fe對小麥成熟胚再生體系的影響[J]. 分子植物育種，2016，14（3）：679-686.

[18]楊素欣，王振鎰. 鹽脅迫下小麥愈傷組織生理生化特性的變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，27（2）：48-51.

[19]Delporte F，Li S R，Jacquemin J M. Calluses initiated from thin mature embryo fragments are suitable targets for wheat transformation as assessed by long-term GUS expression studies[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，80（2）：139-149.

[20]林德書，王艷麗，莊振宏，等. 小麥成熟胚再生體系及基因槍轉(zhuǎn)化的初步研究[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，34（2）：141-144.

[21]Henry Y，de Buyser J. Effect of the 1B/1R translocation on anther culture ability in wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Plant Cell Reports，1985，4（6）：307-310.

[22]zgen M，Türet M，Avci M. Cytoplasmic effects on the tissue culture response of callus from winter wheat mature embryos[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2001，64（1）：81-84.