間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病腎病的研究進(jìn)展

張潔 汪姣 江妍霞 徐積兄

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 330006

糖尿病腎病(DN)已成為發(fā)達(dá)及發(fā)展中國(guó)家導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因。DN的發(fā)病與遺傳易感性、血液動(dòng)力學(xué)改變、晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成、炎性細(xì)胞因子的分泌及氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[1]。病理上主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)性腎小球硬化、系膜擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)纖維化、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及足細(xì)胞減少[2]。早期DN主要表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨著病變進(jìn)展，尿白蛋白排泄率持續(xù)升高，出現(xiàn)大量白蛋白尿，最終可能發(fā)展至尿毒癥期[3]。目前DN的治療主要是通過(guò)控制血糖、血壓、血脂及抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，但這些措施并不能阻止DN向ESRD進(jìn)展。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞治療為DN帶來(lái)了新的希望。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有來(lái)源廣、易獲取及避免胚胎干細(xì)胞倫理相關(guān)問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，已成為近年治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究熱點(diǎn)。

1 MSCs概述

MSCs是一種多功能干細(xì)胞，可以來(lái)自骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶、皮膚、羊水和胎盤(pán)等多種不同的器官或組織。MSCs具有多向分化潛能，能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，在一定條件下，亦能分化為心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞等，并且，MSCs還具有旁分泌血管生成因子、細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力[4]。目前用于治療DN的MSCs有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)。不同來(lái)源的MSCs特性不同，如BM-MSCs具有易于體外擴(kuò)增、可塑性高的特點(diǎn)[5]。ADMSCs具有易獲取、易于體外擴(kuò)增及穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，與BM-MSCs相比有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可表達(dá)更高水平的細(xì)胞因子[4，6]。而UCMSCs具有無(wú)創(chuàng)收集、污染性小、抑制腫瘤生長(zhǎng)和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前在動(dòng)物及臨床研究中，應(yīng)用MSCs治療DN都取得了一定的成功。

2 MSCs治療DN的可能機(jī)制

2.1 調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng) 免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致DN患者腎臟纖維化和結(jié)構(gòu)重塑的關(guān)鍵，樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞都參與其中[8]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能通過(guò)多種方式參與免疫調(diào)節(jié)：(1)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)。巨噬細(xì)胞能分泌大量促炎性細(xì)胞因子及趨化因子，研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從炎性M1表型向抗炎M2表型的轉(zhuǎn)化，可能與MSCs旁分泌的細(xì)胞因子、蛋白酶、趨化因子以及免疫調(diào)節(jié)劑(如長(zhǎng)五肽3)等多種因子有關(guān)。此外，MSCs也能直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子[9]。(2)抑制DC的成熟。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可下調(diào)DC表面CD80、CD86、CD40、OX40L的表達(dá)，調(diào)節(jié)DC中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)1/STAT 6磷酸化，從而抑制DC的成熟[10]。(3)調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的存活、激活和分化。MSCs可通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白D2的表達(dá)，以及CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制。其中MSCs對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群表現(xiàn)出不同的免疫調(diào)節(jié)作用：首先，MSCs可通過(guò)前列腺素E2(PGE2)依賴性方式以及上調(diào)程序性死亡受體1(PD1)的表達(dá)，分別抑制促炎性輔助性T細(xì)胞1(Th1)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和輔助性T細(xì)胞17(Th17)分化。其次，MSCs可通過(guò)多種細(xì)胞因子來(lái)介導(dǎo)抗炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化[11]。(4)MSCs通過(guò)減少活性氧簇的產(chǎn)生發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。循環(huán)高葡萄糖環(huán)境導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇，隨著氧化產(chǎn)物增多可激活核因子-κB，核因子-κB通路被激活后可觸發(fā)促炎分子的產(chǎn)生，促進(jìn)炎性反應(yīng)[3, 12]。研究發(fā)現(xiàn)，UCMSCs外小體可通過(guò)提高細(xì)胞活力和降低氧化產(chǎn)物水平，部分逆轉(zhuǎn)活性氧簇對(duì)細(xì)胞的損傷[13]。此外，MSCs也可通過(guò)降低血糖來(lái)減少活性氧簇的產(chǎn)生[14-15]。然而也有研究提示，干細(xì)胞治療對(duì)血糖水平無(wú)明顯影響。上述不同研究結(jié)果可能與MSCs的培養(yǎng)條件、給藥途徑和劑量等多種因素有關(guān)。總之，MSCs可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及免疫，減少腎組織損傷。

2.2 通過(guò)旁分泌或內(nèi)分泌作用促進(jìn)受損腎臟的修復(fù) 基于MSCs的多項(xiàng)分化潛能，其腎臟修復(fù)作用過(guò)去主要被認(rèn)為因?yàn)闅w巢至受損腎組織，分化為腎固有細(xì)胞。但近年的研究顯示，糖尿病小鼠經(jīng)熒光標(biāo)記的MSCs治療后，腎臟中只檢測(cè)到少量的MSCs，提示MSCs的旁分泌作用可能是減輕腎臟損傷的主要機(jī)制[16]。MSCs可分泌多種營(yíng)養(yǎng)保護(hù)因子及釋放細(xì)胞外囊泡(EVS)，從而減少腎固有細(xì)胞凋亡，減少氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及腎纖維化，以及調(diào)節(jié)腎血管生成來(lái)促進(jìn)腎臟修復(fù)。

MSCs治療DN的主要作用機(jī)制是旁分泌營(yíng)養(yǎng)因子，包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等[15, 17-22](表1)。

表1 MSCs旁分泌的營(yíng)養(yǎng)因子

2.2.1 HGF HGF具有抑制炎性反應(yīng)與纖維化的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HGF可通過(guò)減少單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)來(lái)減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[23]。并且，HGF可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β在腎小球系膜細(xì)胞的表達(dá)[18]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β上調(diào)可引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積累，導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[3, 24]。此外，HGF還可下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的膜定位，減少高血糖刺激的氧化物的產(chǎn)生，從而減少腎臟損傷[18]。

2.2.2 BMP-7 BMP-7是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族的重要成員，可通過(guò)改善腎纖維化、減少足細(xì)胞損傷參與腎臟修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-7可拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad信號(hào)依賴性纖維化[19, 25]。并且，BMP-7可通過(guò)激活Smad 1/5/8的磷酸化，減少足細(xì)胞凋亡，從而維持腎臟正常濾過(guò)作用[21]。

2.2.3 MMP-9 MMP-9是參與ECM代謝的重要酶類，ECM積聚是導(dǎo)致腎臟纖維化的最終途徑。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9對(duì)腎臟纖維化的抑制作用可能與影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)[15]。

2.2.4 其他 EGF可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和損傷，明顯改善足細(xì)胞表達(dá)的突觸素和nephrin蛋白的減少和紊亂[20]。VEGF對(duì)維持腎小管周圍毛細(xì)血管完整性起重要作用[22]。IGF-1可促進(jìn)近端腎小管細(xì)胞增殖，促進(jìn)組織再生[17]。因此，MSCs旁分泌對(duì)腎功能的改善起重要作用。

MSCs不僅可分泌上述可溶性保護(hù)因子促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)，其釋放的EVS介導(dǎo)的遺傳信息傳遞也有重要作用。EVS主要包括外小體及微囊泡。外小體產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)小體，而微囊泡起源于細(xì)胞膜的外芽，二者均攜帶大量蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)[26-27]。EVS不僅直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性，并且在靶細(xì)胞中充當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)，發(fā)揮與MSCs相似的生物活性，在多種腎臟疾病模型中，如缺血-再灌注腎損傷、藥物性腎病、腎血管性疾病、單側(cè)輸尿管梗阻導(dǎo)致的腎病等，均觀察到了EVS的治療效果[26]。

2.3 具有多項(xiàng)分化潛能，歸巢及分化為腎固有細(xì)胞或與其融合，參與腎臟修復(fù) MSCs具有對(duì)組合信號(hào)反應(yīng)并遷移到受損組織中的能力，這一過(guò)程被稱為歸巢[28]。研究發(fā)現(xiàn)，DN受損腎組織局部基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)水平明顯升高，可通過(guò)SDF-1/CXCR 4軸促進(jìn)MSCs歸巢至腎臟，促進(jìn)腎臟的修復(fù)[29]。

MSCs歸巢至受損腎組織后，可分化為腎固有細(xì)胞或與其融合修復(fù)腎臟。(1)腎固有細(xì)胞的分化：研究發(fā)現(xiàn)，ADMSCs可通過(guò)激活素A、低濃度維甲酸與BMP-7的聯(lián)合作用分化為足細(xì)胞樣細(xì)胞，將其移植到阿霉素處理的小鼠體內(nèi)可明顯改善其白蛋白尿和腎損傷[30]。此外，將MSCs與經(jīng)過(guò)氧化氫損傷的系膜細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs可出現(xiàn)系膜細(xì)胞樣形態(tài)的變化[31]。(2)與腎固有細(xì)胞融合：細(xì)胞融合是指兩個(gè)或多個(gè)相同或不同類型的細(xì)胞在組織生長(zhǎng)和再生過(guò)程中結(jié)合在一起，表現(xiàn)出混合基因型和表型[32]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以與心肌細(xì)胞融合，改善心功能，亦能與胰島細(xì)胞融合，維持β細(xì)胞的功能[33-34]。同樣，MSCs與腎臟的固有細(xì)胞融合是否也可以恢復(fù)腎功能？近年研究發(fā)現(xiàn)，將熒光標(biāo)記EVS注射入急性腎損傷大鼠體內(nèi)后，EVS與腎小管上皮細(xì)胞融合，并促進(jìn)血管生成，考慮與EVS直接將VEGF蛋白傳遞到腎小管上皮細(xì)胞有關(guān)[22]。目前關(guān)于MSCs在不同腎臟疾病模型中的研究尚有爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步研究及改善現(xiàn)有的跟蹤可視化技術(shù)，從而觀察MSCs在體內(nèi)與受損的腎固有細(xì)胞之間的“交流”。

3 MSCs治療DN的動(dòng)物研究

近年研究發(fā)現(xiàn)，MSCs治療可明顯改善腎臟指數(shù)及形態(tài)學(xué)異常(表2)，如降低尿白蛋白排泄量、血清尿素、肌酐和尿酸水平，并且，腎小球、腎小管、腎間質(zhì)病理改變明顯緩解[14-16]。 Nagaishi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs培養(yǎng)基與MSCs表現(xiàn)出相似的特性，可抑制骨髓源性細(xì)胞的過(guò)度浸潤(rùn)及炎性因子的表達(dá)，減少腎小管的損傷。將純化的外小體注入糖尿病大鼠單側(cè)腎包膜下后，發(fā)現(xiàn)外小體可抑制腎細(xì)胞凋亡和變性。表明MSCs的治療作用可能主要是通過(guò)EVS和營(yíng)養(yǎng)因子的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

表2 MSCs治療DN的動(dòng)物研究

4 MSCs治療DN的臨床研究

近年國(guó)內(nèi)、外研究者已逐漸開(kāi)展臨床試驗(yàn)，研究基于MSCs干預(yù)措施的安全性、可行性和耐受性，以及對(duì)DN患者的療效。目前有兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)已完成，Packham等[36]將異基因間充質(zhì)前體細(xì)胞輸注于20例成人DN患者體內(nèi)，并與10例安慰劑組患者進(jìn)行對(duì)照，輸注過(guò)程耐受性好，未觀察到異基因細(xì)胞治療的理論風(fēng)險(xiǎn)，然而對(duì)于腎功能的改善作用尚無(wú)明確結(jié)論。趙堂亮等[37]將UCMSCs移植到15例DN患者體內(nèi)，與15例單純口服纈沙坦、皮下注射胰島素治療的DN患者作對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCMSCs移植安全有效，在改善舒張壓、腎功能方面的臨床療效優(yōu)于單純控制血壓、血糖等常規(guī)方法。表明MSCs治療DN已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中取得了一定的成功。

綜上所述，MSCs在治療DN中具有廣闊的應(yīng)用前景，然而還有很多問(wèn)題有待解決，如MSCs的注射部位、給藥途徑、最佳細(xì)胞治療劑量與療程等。當(dāng)然，干細(xì)胞作為一種臨床治療手段，也要評(píng)估其可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，腎臟由不同功能的細(xì)胞組成，干細(xì)胞分化成腎單位取代受損腎單位十分困難，所以在選擇干細(xì)胞時(shí)，除了考慮其分化增殖潛能外，更需考慮其細(xì)胞功能。通過(guò)免疫調(diào)節(jié)和旁分泌的作用，上調(diào)抗炎因子和下調(diào)促炎因子的產(chǎn)生，可減輕腎臟疾病炎性反應(yīng)的發(fā)生，改善腎功能。目前仍需要大量開(kāi)展臨床試驗(yàn)，從而綜合評(píng)估其有效性、可行性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)?？傊杉?xì)胞移植為DN提供了新的治療策略，但如何達(dá)到臨床所期望的效果，有待進(jìn)一步研究探索。