蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的抑菌抗氧化活性

林雄平，姚小芳，彭 彪，周逢芳

(1.寧德師范學院生命科學學院，福建 寧德 352100；2.福建省特色藥用植物工程技術(shù)中心，福建 寧德 352100)

蔓莖堇菜Viola diffusa別名有黃瓜香、匍伏堇、七星蓮、七瓜香等，是堇菜科堇菜屬一年生草本植物[1]。主要分布在浙江、云南、西藏等省區(qū)。蔓莖堇菜微苦、性涼，全草入藥，具有清熱解毒、消腫、消炎等功效[2]。蔓莖堇菜在民間有著悠久的藥用歷史，主治毒蛇咬傷、肺熱引起的咳嗽，黃疸型肝炎，水火燙傷，軟組織損傷等[3]。林曉菁等[4]研究表明蔓莖堇菜生藥學特征明顯，其含有的主要化學組分為糖類、萜類、黃酮等。蔓莖堇菜具有抑菌抗氧化、消除炎癥、調(diào)節(jié)人體免疫等藥理活性[5—11]。Dai 等[12]通過體外活性實驗發(fā)現(xiàn)蔓莖堇菜分離的三萜具有較好的抗HBV 活性。臨床使用蔓莖堇菜合劑治療急性黃疸型肝炎效果顯著。蔓莖堇菜提取物治療再生障礙性貧血有一定效果，對疾病引起的血細胞降低有對抗作用[1]。

柔毛堇菜Viola principis 是堇菜科堇菜屬多年生草本植物。主要產(chǎn)于江蘇、安徽、福建等地的山地林下、草地、溪谷及溝邊路旁等處[13]。Lei 等[14]利用X 射線熒光光譜法研究了重金屬鉛砷在柔毛堇菜體內(nèi)的分布發(fā)現(xiàn)，這兩種重金屬都富集于維管束鞘和柵欄組織內(nèi)。

目前對于蔓莖堇菜的研究主要集中在總?cè)频奶崛　⒖傸S酮的測定提取、藥理作用、藥用成分以及栽培技術(shù)等方面[15—20]。有關(guān)蔓莖堇菜提取物的抗氧化活性和抑菌作用研究較少。對于柔毛堇菜的相關(guān)研究幾乎沒有。本文以蔓莖堇菜和柔毛堇菜提取的多糖為試材，以大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、啤酒酵母Saccharomyces carlsbergensis、黑曲霉菌Aspergillus niger等常見細菌和真菌為供試菌，研究蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的體外抑菌活性和抗氧化活性，為食藥兩用植物資源開發(fā)與利用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料蔓莖堇菜和柔毛堇菜采于2017 年6 月，分別采自福建省寧德市蕉城區(qū)金涵鄉(xiāng)金溪自然村林下和高乾村公路的崖壁上。由寧德師范學院陳勇教授鑒定。

1.1.2菌種真菌菌種：黑曲霉菌、啤酒酵母；細菌菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。以上菌種由寧德師范學院微生物實驗室提供。

1.1.3主要儀器與設(shè)備微型植物粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司，型號FZ102)、HX-105溫水循環(huán)箱(北京長流科學儀器有限公司)、SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器責任有限公司)、SB-1100 EYELA水浴鍋(上海艾藍儀器有限公司)、N-1100 EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海艾藍儀器有限公司)、EYELA FDLL-Z110冷凍干燥機(上海艾藍儀器有限公司)、DK-8D電熱恒溫水箱(上?！憧萍加邢薰?、SiGmR-3-16高速離心冷凍機、SQP電子天平(賽多利斯化學儀器有限公司)、DHP-9272A電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海飛越實驗儀器有限公司)、SW-CJ-2D型(實用垂直新穎)雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、ARZ-1331游標卡尺、LHP-300人工氣候培養(yǎng)箱(上海飛越實驗儀器有限公司)、T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普希通用儀器有限責任公司)、YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1材料處理將兩種堇菜整株包含花和種子分別洗凈后在電風扇下風干，用粉碎機粉碎，過60 篩目，制成堇菜干粉備用。

1.2.2多糖提取稱取蔓莖堇菜干粉，按照料液比1∶40(W/V)加蒸餾水浸泡30 min，再在60 ℃水浴箱中加熱提取70 min，用紗布抽濾，同樣的方法提取兩次，將提取液合并后在80 ℃條件下蒸干、濃縮直至提取液與濃縮液比為12.5∶1。把所獲得的濃縮液六等分，第一份加入1倍無水乙醇，第二份加入2倍無水乙醇，第三份加入3倍無水乙醇，以此類推，第六份加入6倍無水乙醇，6份濃縮液分別記為1、2、3、4、5、6，靜置5 h，進行4500 r·min-1離心10 min后取沉淀，加入等體積3%三氯乙酸靜置12 h，再離心(4500 r·min-1) 10 min后取上清液，在放入冰箱冷凍結(jié)冰前用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濃縮液濃縮至恒重，最后用冷凍干燥機將多糖凍干。柔毛堇菜多糖的提取方法與蔓莖堇菜相同。稱量多糖的質(zhì)量并計算提取得率，計算公式如下：

1.2.3抑菌活性測定將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、無菌水等高壓滅菌20 min(121 ℃)。將接種環(huán)、培養(yǎng)皿、無菌水等放入無菌操作臺紫外滅菌60 min，無菌操作將直徑6 mm 濾紙片分別浸在蔓莖堇菜和柔毛堇菜不同的多糖提取液中(樣品濃度為0.1 g·mL-1)，幾分鐘后取出晾干。將4 種待測菌種用無菌水分別配制成濃度為10-6cfu·mL-1菌懸液。在每個培養(yǎng)皿中倒入適量培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基靜置冷卻后取0.1 mL 菌懸液加入培養(yǎng)皿中，用涂布器涂均勻。再將晾干沾有樣品和空白對照的濾紙片分別貼在不同培養(yǎng)皿中并做好標簽，設(shè)兩個重復組。把培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的培養(yǎng)皿倒置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；啤酒酵母、黑曲霉的培養(yǎng)皿倒置在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h 后觀察菌的生長情況，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每個樣品做3 個平行，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

1.2.4多糖抗氧化檢測將柔毛堇菜和蔓莖堇菜不同方式提取的多糖分別配制成10 mg·mL-1溶液，并取0.2 mL 進行檢測，具體操作步驟參照過氧化氫測定試劑盒說明書。先配制各種應用液，并在37 ℃水浴中預溫10 min，每個管加液時要求在37 ℃中進行，混勻。分光光度儀波長和光徑分別設(shè)置為405 nm 和1 cm，蒸餾水調(diào)零，測定各管的吸光度值?？寡趸芰Π匆韵鹿接嬎?抗氧化能力：U·mL-1；標準品濃度163 mmol·L-1)：

表1 抗氧化試驗不同管的加液量Table 1 The amount of liquid added to different tubes in antioxidant test

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取率

由圖1可知，蔓莖堇菜多糖的提取率最高為7.0%，最低為4.9%，柔毛堇菜多糖的提取率最高最低分別為9.3%和7.8%，蔓莖堇菜多糖提取率極顯著低于柔毛堇菜多糖提取率(P=0.0000 ＜0.01)。這兩種堇菜多糖的提取率會受提取時無水乙醇用量的影響，其中蔓莖堇菜多糖的提取率隨著乙醇用量的增加而遞減，而柔毛堇菜則沒有這個規(guī)律。

2.2 兩種堇菜多糖抗菌活性

2.2.1蔓莖堇菜濃縮液中加入不同體積的無水乙醇，所提取的多糖對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用亦不同。加入與濃縮液等體積的無水乙醇所提取的多糖抗菌作用最強，抑菌圈分別可達8.46 mm和8.59 mm，而加入6倍濃縮液體積的無水乙醇所提取的多糖抗菌能力最弱，抑菌圈分別為7.26 mm和7.45 mm。這可能與無水乙醇的用量會影響多糖中某些抑菌物質(zhì)的沉淀有關(guān)，或與多糖濃度有關(guān)。

圖1 蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharides from Viola diffusa and V.principis

從4種受試菌的敏感性分析，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌對蔓莖堇菜多糖較敏感，而其他2種受試菌的敏感性差，且枯草芽孢桿菌對6種乙醇用量提取的多糖敏感性都強于其他3種受試菌。說明蔓莖堇菜多糖的抗菌活性具有針對性。

比較抗真菌與細菌的抑菌圈發(fā)現(xiàn)，蔓莖堇菜多糖對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都有抑制能力，蔓莖堇菜多糖對黑曲霉和啤酒酵母無抗菌活性。由此可見，蔓莖堇菜多糖對細菌的抗菌活性強于真菌。

表2 蔓莖堇菜多糖抑菌圈直徑(mm)Table 2 Diameter of inhibition zone of polysaccharide from Viola diffusa(mm)

2.2.2柔毛堇菜由表3可知，柔毛堇菜多糖抗菌活性不強，它僅對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌有抑制能力，對其他2種受試菌并沒有抗菌活性。

分析不同體積乙醇提取的多糖抗菌活性，發(fā)現(xiàn)3倍濃縮液體積乙醇提取的柔毛堇菜多糖對大腸桿菌抑制作用最強，抑菌圈可達9.13 mm，與濃縮液等體積乙醇提取的多糖抑制作用最弱，抑菌圈為7.39 mm；而對枯草芽孢桿菌抑制作用最強和最弱的分別是加入1倍和6倍濃縮液體積無水乙醇提取的多糖，抑菌圈分別為9.13 mm和8.75 mm。說明濃縮液中加入不同體積無水乙醇提取的多糖對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌能力不同。

從4種受試菌的敏感性分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌對柔毛堇菜6種多糖都表現(xiàn)出較好的敏感性，其他2種受試菌則不敏感。

比較真菌和細菌的抑菌圈發(fā)現(xiàn)，柔毛堇菜多糖對黑曲霉和啤酒酵母均無抑菌活性，但對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有一定的抑制能力。由此可知，柔毛堇菜多糖的抗細菌活性較強，抗真菌活性較差。

表3 柔毛堇菜多糖抑菌圈直徑(mm)Table 3 Diameter of inhibition zone of polysaccharide from Viola principis (mm)

2.2.3兩種堇菜多糖抑菌活性比較由表2、表3 可知，柔毛堇菜多糖對枯草芽孢桿菌的抗菌能力顯著強于蔓莖堇菜(P=0.0280＜0.05)。當無水乙醇與濃縮液的體積比大于3 時，柔毛堇菜多糖對大腸桿菌抗菌能力也比蔓莖堇菜強。對這兩種堇菜多糖的抗菌活性的均值比較發(fā)現(xiàn)，柔毛堇菜多糖的抗菌活性強于蔓莖堇菜，且差異極顯著(P=0.0042＜0.01)。由此可見，柔毛堇菜多糖的抑制細菌能力強于蔓莖堇菜。從大腸桿菌和枯草芽孢桿菌對堇菜多糖的敏感性分析，枯草芽孢桿菌對兩種堇菜多糖比大腸桿菌敏感。無水乙醇與濃縮液的體積比對蔓莖堇菜多糖的抗細菌能力的影響較小。柔毛堇菜在無水乙醇與濃縮液的體積比為3 時抗大腸桿菌活性最強，蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的抗細菌能力都在無水乙醇與濃縮液等體積時最強。由此可見，蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的抗細菌能力相對比較穩(wěn)定。

2.3 兩種堇菜多糖抗氧化活性

2.3.1蔓莖堇菜由表4 可知，蔓莖堇菜多糖的抗氧化活性與無水乙醇的體積倍數(shù)存在一定關(guān)系。當比值為2 時抗氧化活性最強，為243.64 U·mL-1，當比值為6 時抗氧化活性最弱為172.99 U·mL-1。與上述抗菌能力結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)在蔓莖堇菜多糖中并不是所有物質(zhì)都具有抗菌抗氧化活性。

2.3.2柔毛堇菜不同無水乙醇與濃縮液比值所提取的柔毛堇菜多糖抗氧化活性由強至弱順序為：1 倍＞2 倍＞6 倍＞4 倍＞5 倍＞3 倍?？梢娙崦啦硕嗵堑目寡趸钚耘c提取時所用的無水乙醇的量規(guī)律性不明顯。結(jié)合其抑菌能力分析，認為柔毛堇菜多糖中可能只有某些物質(zhì)具有較強的抑菌抗氧化活性。

2.3.3兩種堇菜多糖的抗氧化活性比較柔毛堇菜多糖的抗氧化活性總體上極顯著高于蔓莖堇菜多糖提取物的抗氧化活性(P=0.0015＜0.01)(表4)。當無水乙醇與濃縮液等體積時相差最大，當兩者體積比為3 時活性相近，進一步說明蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖中僅某些物質(zhì)具有較強的抗氧化活性。柔毛堇菜多糖的抗細菌活性和抗氧化活性幾乎都是無水乙醇與濃縮液等體積時最強，蔓莖堇菜多糖抗細菌活性在無水乙醇與濃縮液等體積時最強，而抗氧化活性以2 倍濃縮液體積時最強。這可能與柔毛堇菜和蔓莖堇菜的多糖物質(zhì)在乙醇中的沉淀不同有關(guān)。

柔毛堇菜多糖抗細菌活性與抗氧化活性多數(shù)比蔓莖堇菜多糖強，且差異顯著(P = 0.0315＜0.05)。但在無水乙醇與濃縮液體積比為1～2 時柔毛堇菜多糖抗大腸桿菌能力比蔓莖堇菜多糖低，說明用水醇法提取的蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的抗細菌活性與醇和濃縮液比例有關(guān)。在無水乙醇體積倍數(shù)相同的情況下，柔毛堇菜多糖的抗細菌跟抗氧化活性幾乎都高于蔓莖堇菜。這說明從柔毛堇菜和蔓莖堇菜提取出相同的多糖物質(zhì)，柔毛堇菜的該種物質(zhì)的抗細菌抗氧化活性一般情況下都會高于蔓莖堇菜，由此可見柔毛堇菜所含多糖的抗菌抗氧化活性高于蔓莖堇菜。

表4 兩種堇菜多糖的抗氧化活性(U·mL-1)Table 4 Antioxidant activity of polysaccharides from two kinds of Viola (U·mL-1)

3 討論

多糖提取方法有多種，如溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波法、酶提取法、超臨界流體萃取法等[21]，其中溶劑提取法的水醇沉淀法是應用最廣泛、最普遍的一種。根據(jù)任國平等[22]對葡萄多糖的研究可知，乙醇用量對多糖的提取率有影響。而多糖的溶解度對其生物活性有一定的影響[23]。本研究證實無水乙醇的用量會影響蔓莖堇菜和柔毛堇菜多糖的提取率，但對兩種堇菜多糖的抗氧化活性和抑菌作用是否有影響還有待后續(xù)研究。

中草藥所含多糖類物質(zhì)有多方面活性，比如抗病毒、降血糖、抗炎、抗腫瘤等[24]。由抑菌實驗可知，柔毛堇菜和蔓莖堇菜多糖都具一定的抑菌能力。與滕蓉[25]的研究比較發(fā)現(xiàn)，柔毛堇菜和蔓莖堇菜多糖對枯草芽孢桿菌的抑制活性接近鬼針草，但對大腸桿菌的抑制活性高于鬼針草。由此說明，蔓莖堇菜和柔毛堇菜在民間作藥用可能與其抑菌能力有關(guān)。

此外，大量研究表明，中草藥的藥理作用與其抗氧化活性密切相關(guān)[26]。蔓莖堇菜水提物的黃酮類物質(zhì)對羥自由基具有良好清除效果，且濃度越高清除率越高[8]。本實驗也表明，蔓莖堇菜也具有一定的抗氧化能力。比較楊曉杰等[27]的研究，柔毛堇菜和蔓莖堇菜對羥基自由基的清除率強于桔梗Platycodon grandiflorus微波提取物。進一步說明在民間蔓莖堇菜和柔毛堇菜作為藥用也可能與其抗氧化活性有關(guān)。

比較兩種堇菜多糖的抗菌抗氧化活性，柔毛堇菜總體上優(yōu)于蔓莖堇菜，且王貝[28]的研究發(fā)現(xiàn)，同屬不同種的貫眾抗菌抗氧化活性差異不顯著。但本實驗的結(jié)果卻表明同屬不同種的堇菜其抗菌抗氧化活性存在顯著差異。根據(jù)徐鴻濤[29]對長鄂堇菜V.inconspicua多糖的研究表明多糖的濃度也會影響其抗氧化和抑制細胞增殖能力，故具體的影響因素還需進一步研究。