• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸棗自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚對人主動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的影響

    2019-07-20 03:26:56李漢卿劉豐銘單樹花張曉莉李卓玉
    食品科學(xué) 2019年13期
    關(guān)鍵詞:酸棗結(jié)合態(tài)酸棗仁

    李漢卿,劉豐銘,單樹花,魯 洋,張曉莉,李卓玉,,*

    (1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006 ;2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006 )

    動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要誘因之一,是一種多因素導(dǎo)致的慢性疾病,動脈粥樣硬化發(fā)病誘因主要有2 個方面:一方面為血管內(nèi)膽固醇等脂質(zhì)的積累,逐漸引起動脈粥樣硬化,導(dǎo)致腦中風(fēng)和冠心病等[1-2];另一方面為機械、炎癥等原因?qū)е卵軆?nèi)皮損傷[3]。人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)是主動脈中膜的主要組成部分[4],存在收縮型和合成型2 種不同表型:收縮型分化程度高,細胞呈紡錘樣細長梭形,增殖和遷移能力較弱,正常成熟血管壁表現(xiàn)為該類型[5-7];而合成型分化程度較低,細胞肥大呈峰谷狀生長,增殖和遷移能力較強。動脈粥樣硬化中期形成動脈粥樣斑塊,主要是HASMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型后,合成型的血管平滑肌細胞經(jīng)過損傷的內(nèi)膜,從血管壁中層遷移到內(nèi)膜。遷移后合成型的血管平滑肌細胞增殖并吞噬低密度脂蛋白[8-10]等脂類蛋白,形成血管平滑肌細胞源性泡沫細胞[11],從而促進動脈粥樣硬化的進程,引發(fā)心腦血管疾病。由此可見,HASMC表型轉(zhuǎn)化是促進動脈粥樣硬化的重要因素,也是當(dāng)今研究熱點之一。

    酸棗(Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)別名野棗,棗屬植物,是棗的原生種,在我國分布較廣[12-13],是生長于我國北方的野生藥用植物資源,有著很高的營養(yǎng)價值和藥用價值,富含糖、有機酸、維生素和多種酚類化合物[14]。研究表明,酸棗仁味甘性平,具有安神鎮(zhèn)靜作用,富含脂肪酸類、三萜類和黃酮類等成分,是治療動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高頻藥物之一[15-16];酸棗葉中提取到的酸葉酮、蘆丁等成分可以治療冠心病等心腦血管疾病;酸棗肉中富含許多可溶性糖、多種有機酸、礦質(zhì)元素[17]和氨基酸等營養(yǎng)成分,對于動脈粥樣硬化的治療也有一定作用。近年來,有研究證明酸棗具有防病抗衰老與延年益壽的作用[18],這些與酸棗中的多酚類物質(zhì)密不可分。

    本實驗以酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉為原材料,運用不同方法提取自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚,對其不同方法提取的多酚質(zhì)量濃度進行了測定,并研究了各種多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響,為動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供一定的理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    酸棗葉、酸棗肉和酸棗仁 國藥控股國大藥房山西益源連鎖有限公司。

    HASMC 美國模式培養(yǎng)物集存庫;DMEM/F-12(HAM)1∶1培養(yǎng)基 美國Biological Industries公司;無支原體胎牛血清 美國Gibco公司;噻唑藍、福林-酚試劑、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 北京索萊寶科技公司;二甲基亞砜 美國Amresco公司;胰蛋白酶 北方同正公司;血管緊張素II(angiotensin II,AngII) 上海阿拉丁試劑有限公司;乙醇、碳酸鈉、沒食子酸、氫氧化鈉等均為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

    1.2 儀器與設(shè)備

    5417離心機 德國Eppendorf公司;756MC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國Millipore公司;CO2細胞培養(yǎng)箱、真空冷凍干燥機 美國Thermo公司;Delta Vision Elite系統(tǒng) 美國Applied Precision公司;倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;細胞培養(yǎng)板 美國Hyclone公司。

    1.3 方法

    1.3.1 酸棗多酚的有機溶劑法提取

    樣品預(yù)處理:酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉用組織研磨儀粉碎為粉末狀。

    自由態(tài)多酚提?。悍謩e稱取酸棗肉粉、酸棗仁粉和酸棗葉粉各10 g,加入適量預(yù)熱的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液,攪拌均勻后靜提1 h,然后將混合物5 000 r/min離心10 min,收集上清液。重復(fù)上述方法,收集上清液。將2 次收集的上清液混合后在80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡乙醇,最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥即相應(yīng)為酸棗肉自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba flesh free polyphenol-ethyl alcohol,ZSFFP-E)、酸棗仁自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba seeds free polyphenolethyl alcohol,ZSSFP-E)、酸棗葉自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba leaves free polyphenol-ethyl alcohol,ZSLFP-E)。在-20 ℃保存,使用時用超純水溶解。

    結(jié)合態(tài)多酚提?。簩⑻崛⊥曜杂蓱B(tài)多酚的酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉沉淀按如下2 種方法消化:1)加入100 mL NaOH消化;2)加入100 mL的甲醇和濃硫酸配制的混合溶液消化,在室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h,然后在混合物中加入適量HCl,調(diào)pH值至7,終止消化。然后將混合物在11 000 r/min離心10 min,取上清液。在上清液中加入等體積的乙酸乙酯后充分?jǐn)嚢瑁?1 000 r/min離心10 min,重復(fù)5 次充分除脂。將多酚提取液在70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機溶劑后停止,最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥,分別得到6 種結(jié)合態(tài)多酚:酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSFBP-1-E)、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSSBP-1-E)、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSLBP-1-E)、酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSFBP-2-E)、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSSBP-2-E)、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSLBP-2-E)。在-20 ℃保存,使用時用超純水溶解。

    1.3.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度的測定

    采用福林-酚比色法,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL。將1 mL樣品移入離心管,12 000×g離心15 min。加100 μL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品和400 μL去離子水到試管中。加100 μL福林-酚試劑,混勻靜置6 min。然后加1 mL的7% Na2CO3和0.8 mL去離子水,混勻靜置90 min。用紫外-可見分光光度計在760 nm波長處檢測吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo),沒食子酸質(zhì)量(mg)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.443 1x+0.016 1(R2=0.998 9),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中多酚的質(zhì)量濃度。

    1.3.3 細胞培養(yǎng)

    HASMC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F-12(HAM)1∶1培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

    用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,經(jīng)胰酶消化后制成細胞懸液,采用血球計數(shù)板進行計數(shù),用無血清培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋細胞濃度至5 000 個/孔,接種到96 孔板中饑餓處理24 h,使細胞周期同步。然后棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入100 μL含有多酚和10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基,每種多酚設(shè)置5 個平行孔,待處理24、48 h后,在倒置顯微鏡下觀察HASMC的表型轉(zhuǎn)化情況,并在拍照視野內(nèi)隨機選取50 個細胞測量其長度和寬度,求其平均值。

    1.3.5 細胞熒光染色觀察

    將蓋玻片酸泡過夜,蒸餾水沖洗干凈,浸泡于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中,使用時將蓋玻片上乙醇燒干,鋪于12 孔板中,將用無血清培養(yǎng)基稀釋好的濃度為20 000 個/mL的HASMC鋪于12 孔板中,饑餓處理24 h。待處理完成后棄掉無血清培養(yǎng)基,分別加入1 mL含10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基,然后加入ZSSBP-2-E、ZSLFP-E,終質(zhì)量濃度分別為0.15、1.5 mg/mL,處理48 h。吸棄培養(yǎng)基,用37 ℃預(yù)熱的pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 次,每孔加入600 μL免疫熒光固定液固定10 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加入500 μL 0.5% TritionX-100溶液透化處理5 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液,室溫避光孵育30 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L DAPI溶液,室溫避光孵育30 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。在載玻片中央滴加適量抗熒光猝滅劑,將蓋玻片從12 孔板中取出倒置在載玻片上,封片劑封片后用Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC表型轉(zhuǎn)化情況。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    所有數(shù)據(jù)均為3 次獨立實驗的結(jié)果,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析,組間差異分析采用t檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉自由態(tài)及結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度

    表1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度Table 1 Contents of free and bound polyphenols in the flesh,seeds and leaves

    由表1可知,酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSLFP-E>ZSLBP-2-E>ZSLBP-1-E;酸棗肉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSFFP-E>ZSFBP-1-E>ZSFBP-2-E;酸棗仁中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSSFP-E>ZSSBP-1-E>ZSSBP-2-E。酸棗肉、酸棗仁和酸棗葉中自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度均高于結(jié)合態(tài)多酚。自由態(tài)多酚中ZSLFP-E得率最高,結(jié)合態(tài)多酚中ZSLBP-2-E得率最高。

    2.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

    圖1 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(24 h)Fig. 1 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (24 h)

    表2 圖1中細胞的長度和寬度Table 2 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 1

    圖2 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(48 h)Fig. 2 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (48 h)

    表3 圖2中細胞的長度和寬度Table 3 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 2

    圖3 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(24 h)Fig. 3 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (24 h)

    表4 圖3中細胞的長度和寬度Table 4 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 3

    圖4 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(48 h)Fig. 4 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (48 h)

    表5 圖4中細胞的長度和寬度Table 5 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 4

    用提取的9 種多酚(終質(zhì)量濃度0.25 mg/mL)分別處理HASMC 24、48 h并觀察其表型轉(zhuǎn)化。6 種結(jié)合態(tài)多酚處理組與對照組、AngII處理組對比,ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變(圖1、表2),ZSLBP-1-E影響HASMC的存活率,因此未統(tǒng)計HASMC細胞表型轉(zhuǎn)變;隨時間的延長,ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)進一步向收縮型轉(zhuǎn)變(圖2、表3);3 種自由態(tài)多酚處理組與對照組、AngII處理組對比,ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變(圖3、表4);隨時間的延長,ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)進一步向收縮型轉(zhuǎn)變(圖4、表5)。以上結(jié)果表明,9 種多酚中,ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC明顯由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型,并且呈現(xiàn)時間依賴性。

    2.3 不同質(zhì)量濃度ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

    圖5 倒置顯微鏡觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 5 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with under an inverted microscope

    表6 圖5中細胞的長度和寬度Table 6 Measurement results of the length and width of cells in Fig. 5

    為了解不同質(zhì)量濃度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC形態(tài)的影響,用不同質(zhì)量濃度梯度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E處理HASMC并觀察其表型轉(zhuǎn)化,隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加,HASMC形態(tài)向收縮型轉(zhuǎn)變更加明顯(圖5、表6),同時隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加,收縮型細胞數(shù)量在增加。以上結(jié)果表明:ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型,并且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度梯度依賴性。

    2.4 熒光染色實驗觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

    圖6 Delta Vision Elite觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 6 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with free polyphenols from leaves and bound polyphenols from seeds obtained by acid digestion under Delta Vision Elite system

    為了更加直觀地觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型的轉(zhuǎn)化作用,用FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對HASMC細胞骨架進行染色,用DAPI對HASMC細胞核進行染色,通過Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC形態(tài)。由圖6可知,用ZSLFP-E和ZSSBP-2-E兩種藥物分別處理HASMC后,細胞形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變。

    3 討 論

    動脈粥樣硬化是一種慢性疾病,其發(fā)病誘因多種多樣,如不良習(xí)慣、肥胖、高血壓、糖尿病等[19-22],而HASMC的形態(tài)變化是重要內(nèi)因之一。HASMC存在收縮型和合成型2 種不同表型,收縮型增殖、遷移能力較弱,細胞呈現(xiàn)紡錘樣細長梭形,合成型細胞增殖、遷移能力較強,細胞肥大呈峰谷狀生長。不同的刺激可能引起HASMC由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?,并開始遷移、增殖,從而促進動脈粥樣硬化的形成[23]。近幾年來,對于HASMC表型轉(zhuǎn)化的研究是熱門之一,植物中有效成分對于HASMC表型的轉(zhuǎn)化已有很多報道,如具有降血壓、抗氧化、神經(jīng)保護等作用的姜黃素[24-25],可以促進主動脈平滑肌細胞由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變[26]。而多酚對于影響HASMC表型轉(zhuǎn)變的研究也有許多。如鄔秋德等[27]的研究表明黃酒多酚可以抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動脈平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)化,從而能夠預(yù)防一些心血管疾病的發(fā)生。

    因此,本實驗通過不同方法提取酸棗不同部位(酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉)的自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚,并用提取的多酚進行體外實驗,研究其對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響。首先通過多酚的提取和測定,發(fā)現(xiàn)酸棗葉中的自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠高于其他部位提取的自由態(tài)多酚,且酸棗葉中用甲醇和濃硫酸混合液消化法提取的結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠高于其他部位提取的結(jié)合態(tài)多酚。在所提取的9 種多酚中,ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可明顯促進HASMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變,且呈現(xiàn)良好的時間和劑量依賴性。因此,這兩種多酚對于實際生活中預(yù)防和治療動脈粥樣硬化有很好的研究價值。未來可針對這兩種藥物深入探討其發(fā)揮功效的單一組分,并且研究其影響HASMC形態(tài)調(diào)控的基因,以期提供低毒、高效的預(yù)防動脈粥樣硬化的保健品和新型藥物。

    猜你喜歡
    酸棗結(jié)合態(tài)酸棗仁
    冬種紫云英對石灰性水稻土紫潮泥鋅形態(tài)的影響
    小酸棗打開農(nóng)民就業(yè)增收路
    酸棗化學(xué)成分及藥理作用研究進展
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:46
    酸棗仁:失眠嗜睡均可調(diào)
    提高酸棗栽植成活率的措施
    河北果樹(2020年1期)2020-02-09 12:31:42
    酸棗仁湯治療甲亢失眠的效果觀察
    歸脾湯與酸棗仁湯合用治療抑郁癥25例療效觀察
    pH和腐植酸對Cd、Cr在土壤中形態(tài)分布的影響
    腐植酸(2015年1期)2015-04-17 00:42:42
    荔枝果皮的結(jié)合態(tài)POD及其在果實生長發(fā)育過程中的變化
    氫氧化鐵和腐殖酸結(jié)合態(tài)鎘在文蛤體內(nèi)的富集
    腐植酸(2014年2期)2014-04-18 08:41:55
    伦理电影免费视频| 五月开心婷婷网| 久久久精品区二区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利欧美成人| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久热这里只有精品99| 久久久精品免费免费高清| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲国产看品久久| 韩国精品一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女视频免费永久观看网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 嫩草影视91久久| 丁香欧美五月| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成77777在线视频| 在线看a的网站| 高清毛片免费观看视频网站 | 一级毛片女人18水好多| 中文字幕av电影在线播放| 无限看片的www在线观看| av不卡在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕制服av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 首页视频小说图片口味搜索| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 午夜成年电影在线免费观看| 国产淫语在线视频| 超碰97精品在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产高清videossex| 成人国语在线视频| 日韩欧美在线二视频 | 精品乱码久久久久久99久播| 国产av精品麻豆| 久久久久久久久久久久大奶| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产精品合色在线| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av熟女| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产一区二区激情短视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 69av精品久久久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 首页视频小说图片口味搜索| 国产成人免费无遮挡视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| av免费在线观看网站| 嫩草影视91久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美午夜高清在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 怎么达到女性高潮| 男人操女人黄网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色成人免费大全| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品亚洲成国产av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲九九香蕉| 视频区图区小说| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人18禁在线播放| 国产亚洲精品一区二区www | 一级a爱片免费观看的视频| 99热只有精品国产| 精品福利永久在线观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 男男h啪啪无遮挡| 水蜜桃什么品种好| 日本欧美视频一区| 成在线人永久免费视频| 丝袜人妻中文字幕| 成人三级做爰电影| 亚洲av片天天在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 麻豆成人av在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久精品成人免费网站| 国产区一区二久久| 亚洲av片天天在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品久久久av美女十八| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 伦理电影免费视频| 欧美精品亚洲一区二区| videos熟女内射| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美大码av| 美国免费a级毛片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 波多野结衣av一区二区av| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 99久久综合精品五月天人人| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲一区中文字幕在线| 男女午夜视频在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产精品偷伦视频观看了| 狂野欧美激情性xxxx| 免费在线观看日本一区| 亚洲专区国产一区二区| 久热这里只有精品99| 男女之事视频高清在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 色婷婷av一区二区三区视频| www.精华液| 窝窝影院91人妻| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜日韩欧美国产| 乱人伦中国视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产精品成人在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产精品合色在线| 国产xxxxx性猛交| 成人免费观看视频高清| 国产精品免费大片| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品一区二区在线观看99| 777米奇影视久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av有码第一页| 午夜久久久在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 黄色视频,在线免费观看| 777米奇影视久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 女人久久www免费人成看片| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲欧美激情综合另类| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品久久电影中文字幕 | 露出奶头的视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久国产精品影院| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产单亲对白刺激| 身体一侧抽搐| 天堂中文最新版在线下载| 久久影院123| 亚洲专区中文字幕在线| a级毛片在线看网站| 午夜免费鲁丝| 在线观看一区二区三区激情| 国产欧美日韩一区二区精品| 水蜜桃什么品种好| 丝袜美腿诱惑在线| 人人澡人人妻人| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 制服诱惑二区| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利在线免费观看网站| av天堂久久9| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 99久久人妻综合| 男女下面插进去视频免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看免费视频网站a站| 免费观看a级毛片全部| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利,免费看| 亚洲免费av在线视频| 九色亚洲精品在线播放| 在线天堂中文资源库| 久久久国产成人精品二区 | 黄片小视频在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久国产精品大桥未久av| 成人18禁在线播放| 免费黄频网站在线观看国产| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲美女黄片视频| 久9热在线精品视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲综合色网址| 亚洲精品国产区一区二| 久久中文字幕一级| 脱女人内裤的视频| 成年动漫av网址| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色丝袜av网址大全| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲五月天丁香| 黄色毛片三级朝国网站| 精品国产美女av久久久久小说| bbb黄色大片| 黄色成人免费大全| 99精国产麻豆久久婷婷| 脱女人内裤的视频| a级片在线免费高清观看视频| 性少妇av在线| 老汉色∧v一级毛片| 大型av网站在线播放| 久久热在线av| 免费看a级黄色片| 久久性视频一级片| 国产乱人伦免费视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久,| 日韩人妻精品一区2区三区| 在线国产一区二区在线| 啦啦啦 在线观看视频| av网站在线播放免费| 12—13女人毛片做爰片一| 夜夜爽天天搞| 一本大道久久a久久精品| 久久久久精品人妻al黑| 欧美精品av麻豆av| 久久亚洲精品不卡| 91麻豆av在线| 午夜福利视频在线观看免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产麻豆69| 热re99久久精品国产66热6| 性色av乱码一区二区三区2| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产看品久久| 很黄的视频免费| 精品国产亚洲在线| 亚洲精华国产精华精| 亚洲一区二区三区不卡视频| 五月开心婷婷网| 久久影院123| 精品国产一区二区三区四区第35| 99热网站在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 满18在线观看网站| 超碰成人久久| 大香蕉久久网| 人人澡人人妻人| 午夜福利乱码中文字幕| 国产亚洲欧美98| 国产高清视频在线播放一区| 后天国语完整版免费观看| 水蜜桃什么品种好| 免费观看人在逋| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 国产不卡一卡二| 国产麻豆69| 老汉色∧v一级毛片| 麻豆av在线久日| 超碰成人久久| 男女之事视频高清在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久精品国产综合久久久| tocl精华| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲五月天丁香| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美黄色片欧美黄色片| 9色porny在线观看| 99热只有精品国产| 国产高清国产精品国产三级| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品午夜福利视频在线观看一区| 91成人精品电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久国产精品影院| 电影成人av| 亚洲专区字幕在线| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲色图综合在线观看| www.999成人在线观看| av天堂久久9| 亚洲国产看品久久| 婷婷丁香在线五月| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 热99re8久久精品国产| 超碰97精品在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲一区中文字幕在线| 交换朋友夫妻互换小说| 国产乱人伦免费视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久中文字幕一级| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄色视频,在线免费观看| 成人精品一区二区免费| 亚洲av电影在线进入| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲男人天堂网一区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线观看一区二区三区激情| 老司机福利观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲免费av在线视频| av中文乱码字幕在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自线自在国产av| 免费观看a级毛片全部| 不卡一级毛片| 制服诱惑二区| ponron亚洲| 欧美日韩视频精品一区| ponron亚洲| 一级作爱视频免费观看| 好男人电影高清在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 国产深夜福利视频在线观看| x7x7x7水蜜桃| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲成国产人片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 视频区图区小说| 亚洲 国产 在线| 国产国语露脸激情在线看| 午夜精品国产一区二区电影| x7x7x7水蜜桃| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲综合色网址| 国产一区在线观看成人免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费少妇av软件| 女人被狂操c到高潮| 日韩成人在线观看一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产97色在线日韩免费| 99re在线观看精品视频| www.精华液| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品第一国产精品| www.999成人在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 91成年电影在线观看| 色播在线永久视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日本a在线网址| 色老头精品视频在线观看| av网站免费在线观看视频| 曰老女人黄片| 视频在线观看一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产99白浆流出| 国产欧美日韩一区二区精品| 丝瓜视频免费看黄片| 国产国语露脸激情在线看| 久久精品国产a三级三级三级| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜福利视频在线观看免费| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产av一区二区精品久久| 色尼玛亚洲综合影院| 久久精品国产清高在天天线| 人人澡人人妻人| 欧美日本中文国产一区发布| 成人精品一区二区免费| 黄频高清免费视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产成人精品无人区| 国产精品国产高清国产av | 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩一级在线毛片| 国产野战对白在线观看| 午夜久久久在线观看| 欧美午夜高清在线| 99精品在免费线老司机午夜| 色94色欧美一区二区| 美国免费a级毛片| 在线看a的网站| 九色亚洲精品在线播放| 成年人黄色毛片网站| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 欧美人与性动交α欧美软件| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 在线观看日韩欧美| 精品人妻1区二区| 成人国语在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 俄罗斯特黄特色一大片| 下体分泌物呈黄色| 99riav亚洲国产免费| 999精品在线视频| 99久久国产精品久久久| 免费少妇av软件| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜福利,免费看| 国精品久久久久久国模美| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 日本黄色视频三级网站网址 | 99re在线观看精品视频| 久久人妻av系列| 黄色视频不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产国语露脸激情在线看| 色在线成人网| 日韩欧美在线二视频 | 精品国产国语对白av| 欧美日韩乱码在线| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜福利乱码中文字幕| 十分钟在线观看高清视频www| 免费少妇av软件| 成人影院久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩大码丰满熟妇| 亚洲全国av大片| 久久久久视频综合| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品高清国产在线一区| 亚洲七黄色美女视频| 黄色成人免费大全| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲美女黄片视频| 欧美精品av麻豆av| 色94色欧美一区二区| 久久精品国产综合久久久| 大型av网站在线播放| 日本黄色视频三级网站网址 | 美女午夜性视频免费| 制服人妻中文乱码| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产免费现黄频在线看| 热99国产精品久久久久久7| 最近最新免费中文字幕在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av熟女| a级毛片在线看网站| www.精华液| 久久久精品免费免费高清| 少妇的丰满在线观看| 午夜影院日韩av| 久久精品亚洲av国产电影网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中文字幕人妻丝袜制服| 黄色毛片三级朝国网站| 99国产精品免费福利视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 老司机在亚洲福利影院| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 搡老岳熟女国产| 女人精品久久久久毛片| 国产在线观看jvid| 国产成人啪精品午夜网站| 国产91精品成人一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产三级黄色录像| 91在线观看av| 国产有黄有色有爽视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 老司机在亚洲福利影院| 又大又爽又粗| 不卡一级毛片| 一区在线观看完整版| 国产一区二区三区视频了| 99香蕉大伊视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 黄片播放在线免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 男女免费视频国产| 黄色成人免费大全| 成人手机av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人免费av在线播放| 婷婷丁香在线五月| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 免费看a级黄色片| 亚洲综合色网址| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 黑丝袜美女国产一区| 成年人午夜在线观看视频| 最新的欧美精品一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 十分钟在线观看高清视频www| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲avbb在线观看| 国产av一区二区精品久久| 正在播放国产对白刺激| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美成人午夜精品| 香蕉国产在线看| 999久久久国产精品视频| 夫妻午夜视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品乱久久久久久| 捣出白浆h1v1| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人av教育| 欧美午夜高清在线| 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品国产国语对白av| a在线观看视频网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄色a级毛片大全视频| 在线看a的网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产人伦9x9x在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久久精品区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 美国免费a级毛片| 成人黄色视频免费在线看| 成年动漫av网址| 精品卡一卡二卡四卡免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩免费av在线播放| 国产精品久久电影中文字幕 | av国产精品久久久久影院| 男女下面插进去视频免费观看| 91字幕亚洲| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产成人精品久久二区二区免费| 久久精品91无色码中文字幕| 91成人精品电影| 看免费av毛片| 91av网站免费观看| 欧美性长视频在线观看| 中国美女看黄片| 欧美亚洲日本最大视频资源| e午夜精品久久久久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品国产色婷婷电影| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲av日韩在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 电影成人av| 久久久精品区二区三区| 制服诱惑二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成国产人片在线观看| 两个人免费观看高清视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 午夜福利,免费看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久热爱精品视频在线9| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 人妻久久中文字幕网| 18禁国产床啪视频网站| 美女福利国产在线| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| av福利片在线|