響應面法優(yōu)化黃芪總黃酮提取工藝及初步純化

袁惠君，李 欣，賈鴻震，袁毅君

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730000；3.天水師范學院，甘肅 天水 741000）

中藥黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceusvar.mongholicus)或膜莢黃芪(A.membranaceus)的根[1]，富含多糖、皂苷和總黃酮等多種生物活性成分，其中總黃酮主要包括毛蕊異黃酮、芒柄花素及其糖苷成分，具有抗輻射、清除氧自由基、抑菌、增強機體免疫和抗病毒等功能[2-3]，常作為保健因子添加到食品中，也是飼料中常用的生長免疫增強劑成分，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)上被廣泛應用，具有增強免疫，提高動物生產(chǎn)性能、產(chǎn)品品質(zhì)等功效[4]。

黃芪總黃酮提取最常規(guī)的方法是乙醇回流法[4]，但由于不同產(chǎn)地藥材活性成分性質(zhì)的差異，其提取工藝參數(shù)不同。單因素法和Box-Behnken響應面設(shè)計法是優(yōu)化提取工藝研究常用的方法[5-6]，其中響應面法是一種采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的統(tǒng)計方法，具有試驗周期短，回歸方程精度高，能分析多種因素交互作用等優(yōu)點，已被廣泛用于各種工藝參數(shù)的優(yōu)化[5]。

總黃酮的純化方法主要有大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法、聚酰胺柱層析法和葡聚糖凝膠柱層析法等[7]，其中大孔吸附樹脂法因其吸附量大、解析率高、選擇性強和成本低等優(yōu)點成為黃酮類、生物堿等多種活性成分提取的有效方法之一[8]，但也存在因部分黃酮不溶于水而難以富集純化的問題[9-11]。聚酰胺是一類以酰胺鍵聚合而成的高分子化合物，主要通過大量酰胺基與黃酮類化合物的酚羥基形成氫鍵而進行吸附，可除去色素和部分脂溶性化合物，可有效彌補大孔吸附樹脂的部分不足[12-13]。

黃芪藥材來源駁雜，全國不同地方常用同屬植物的根都作為黃芪，甘肅黃芪以宕昌和隴西產(chǎn)的藥材在外觀性狀和有效成分含量方面最優(yōu)[14-15]，但其詳細的分離純化工藝研究未見報道。本研究以甘肅宕昌產(chǎn)黃芪為材料，通過單因素試驗和響應面分析對黃芪總黃酮最佳提取工藝進行研究，并利用HPD722大孔吸附樹脂-聚酰胺柱層析聯(lián)用法進行富集純化，以期為深入研究黃芪總黃酮產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃芪產(chǎn)自甘肅省隴南市宕昌縣哈達鋪。蘆丁純度為91.7%，購自中國食品藥品檢定研究院。毛蕊異黃酮和芒柄花素純度分別為99.08%和99.03%，均購自成都曼思特生物科技有限公司。乙醇、氯仿、正丁醇、H2O2、苯酚、濃硫酸等均為分析純；聚酰胺(過孔徑450 μm樣品篩)和HPD722大孔吸附樹脂購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HH-4型，京科偉永興儀器有限公司)，高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國安捷倫公司)，紫外分光光度計(UV-1800，日本島津公司)，天平(AE260，瑞士梅特勒公司)，超純水機(AFX2-0501-P，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)，高速多功能粉碎機(CXP-100，上海市晟喜制藥機械有限公司)，超聲波清洗器(SK3310LHC，上?？茖С晝x器有限公司)，遠紅外快速干燥箱(766-3，江蘇省南通縣金余電器配件廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5299，鞏義市予華儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黃芪總黃酮提取

黃芪藥材粉碎后過孔徑450 μm樣品篩，準確稱取2 g，置于100 mL圓底燒瓶中，參考預試驗，按一定料液比加入不同乙醇體積分數(shù)，80 ℃水浴回流提取一定時間，過濾后定容至25 mL，即為黃芪總黃酮粗提液。

1.2.2 黃芪總黃酮粗提液含量測定

標準曲線制作：稱取蘆丁10 mg，用40%乙醇溶解并定容至50 mL，即為蘆丁對照品(0.204 mg·mL-1)。取10 mL具塞比色管7只，分別吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁對照品，用40%乙醇補至5 mL，混勻后加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，靜置6 min。加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min。最后加入4 mL 4% NaOH溶液，用40%乙醇定容10 mL，混勻后靜置15 min。以40%乙醇為空白，在510 nm處測定吸光值[16]。以濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，吸光值A(chǔ)(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，Y= 0.012 2X- 0.008 2，r= 0.999 8。蘆丁含量在5.1～61.2 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。黃芪總黃酮粗提液含量的測定同法操作。提取量(mg·g-1) = 粗提液中總黃酮含量/藥材質(zhì)量。

1.3 單因素試驗

準確稱取2 g黃芪藥材粉，置于100 mL圓底燒瓶中，在料液比為1∶15，提取時間90 min，乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%和80%條件下，測定總黃酮提取量，分析乙醇體積分數(shù)對黃芪總黃酮提取量的影響；在乙醇體積分數(shù)為70%，提取時間90 min，料液比(g∶mL)分別為1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19 條件下，測定總黃酮提取量，分析料液比對黃芪總黃酮提取量的影響；在乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶17，提取時間分別為 20、40、60、80、100和120 min條件下，測定總黃酮提取量，分析提取時間對黃芪總黃酮提取量的影響。每試驗重復3次。

1.4 響應面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設(shè)計進行響應面優(yōu)化設(shè)計，以乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間為響應變量，黃芪總黃酮提取量為響應值，設(shè)計3因素3水平，共17個試驗點。試驗因素水平如表1所列。

1.5 大孔吸附樹脂富集黃芪總黃酮

大孔吸附樹脂預處理：稱取適量HPD722樹脂，用95%乙醇充分浸泡過夜，除去樹脂中的碎片和雜物后乙醇濕法裝柱，用乙醇持續(xù)沖柱，隨時檢查流出液，沖至與水混合不呈白色渾濁為止，然后用大量蒸餾水洗掉層析柱內(nèi)乙醇，備用。稱取100 g經(jīng)過預處理的HPD722大孔吸附樹脂，取上述最佳條件下制備的黃芪總黃酮濃縮液，調(diào)整濃度為0.71 mg·mL-1，pH 3.0，依據(jù)預試驗，上樣速度為2 mL·min-1，上樣體積為3柱床體積(bed volume，BV)，4 BV蒸餾水除雜，6 BV 70%乙醇解吸附，收集解析液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃芪總黃酮[17]。

1.6 聚酰胺樹脂富集黃芪總黃酮

聚酰胺預處理：稱取適量聚酰胺樹脂，用95%乙醇充分浸泡過夜，乙醇濕法裝柱，用乙醇持續(xù)沖柱，隨時檢查流出液，沖至與水混合不呈白色渾濁為止，然后用大量蒸餾水洗掉層析柱內(nèi)乙醇，備用。稱取30 g經(jīng)預處理后過孔徑450 μm樣品篩的聚酰胺，參考預試驗，上述黃芪總黃酮以1 mL·min-1上樣1 BV，30%乙醇3 BV除雜，90%乙醇3 BV解吸附，收集解析液60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃芪總黃酮[18]。

1.7 毛蕊異黃酮和芒柄花素含量測定

色譜條件參考文獻[19]：色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈 (A)和 0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序為0-15 min 30%A和70% B，15-35 min 65% A和35% B；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫25 ℃；進樣量為 20 μL。

精密稱取3份0.1 g純化的黃芪總黃酮粉末，均用流動相A溶解定容至25 mL，分別進樣20 μL測定，利用外標法計算黃芪總黃酮主要成分毛蕊異黃酮和芒柄花素含量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面分析并繪制響應曲面圖，Origin7.5軟件制圖。

表1 Box-Behnken因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

隨著乙醇體積分數(shù)增加，黃芪總黃酮提取量顯著增加(P＜ 0.05)，并在乙醇體積分數(shù)為70%時達到最大，然后隨乙醇體積分數(shù)增加而降低(圖1a)，這是因為當乙醇體積分數(shù)為70%時，黃芪總黃酮溶出趨于飽和，隨后其他醇溶性或脂溶性物質(zhì)開始溶出，從而使黃芪總黃酮提取量下降[20]。故乙醇體積分數(shù)選擇70%。

當料液比(g∶mL)在1∶9～1∶17范圍內(nèi)，黃芪總黃酮提取量隨料液比增加而增加(P＜ 0.05)，并在料液比(g∶mL)1∶17時達到峰值，隨后繼續(xù)增加料液比，因其他醇溶性雜質(zhì)開始逐漸溶出，導致黃芪總黃酮提取量反而下降(圖1b)。因此，料液比(g∶mL)以1∶17為最佳。

隨提取時間的延長，黃芪總黃酮提取量顯著增加(P＜ 0.05)，但在60 min以后提取量增幅減小(圖1c)，表明提取時間60 min時大部分黃芪總黃酮已溶出，繼續(xù)延長提取時間，可能導致黃芪總黃酮被氧化[21]。因此，選擇最佳提取時間為60 min。

2.2 響應面試驗結(jié)果

基于表1 響應面設(shè)計進行的試驗結(jié)果如表2所列。通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行響應面分析后得到以黃酮提取量為響應值的回歸方程為Y=2.72 + 0.13A+ 0.076B+ 0.031C - 0.027AB+ 0.058AC+0.13BC- 0.66A2- 0.27B2- 0.072C2。如表3所列，二次回歸模型P＜ 0.000 1，失擬項P= 0.768 7 ＞ 0.05，決定系數(shù)R2= 0.980 7，校正系數(shù)Radj2= 0.955 9，與決定系數(shù)R2接近，說明該模型回歸顯著、準確，與試驗結(jié)果擬合度良好。F值越大表明該變量對黃酮提取量的影響越大[22]，因此3種因子對黃芪總黃酮提取量的影響依次為乙醇體積分數(shù) ＞ 料液比 ＞提取時間。BC交互作用顯著影響黃芪總黃酮提取量(P＜ 0.05)，而AB、AC交互作用不影響黃芪總黃酮的提取量 (P＞ 0.05)。

2.3 響應面分析

比較3組等高曲線圖可知：乙醇體積分數(shù)和料液比對黃芪總黃酮提取量的影響顯著，表現(xiàn)為曲線陡峭(圖2a、圖2b)，表明黃芪總黃酮提取量對各參數(shù)的變化較敏感；提取時間影響不顯著，曲線表現(xiàn)較為平緩圓潤(圖2c)，說明黃芪總黃酮提取量對提取時間的變化不敏感[23]，與方差分析結(jié)果相一致。

圖1 乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間對黃芪總黃酮提取量的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration,solid/liquid ratio,and extraction time on the extraction content of TFA

表2 Behnken試驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results with Box-Behnken

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

圖2 兩因素交互作用的響應面分析Figure 2 Response surface of three interacting factors

回歸模型預測分析表明，黃芪總黃酮最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)71.17%，料液比(g∶mL) 1∶17.5，提取時間69.6 min，總黃酮提取量最大預測值可達到2.75 mg·g-1。為方便實際操作，將最優(yōu)條件簡化為乙醇體積分數(shù)70%，料液比(g∶mL) 1∶17，提取時間70 min，該條件下進行3次平行驗證試驗，黃芪總黃酮提取量達到2.78 mg·g-1(表4)，RSD為1.41%，與模型預測值誤差為1.09%。說明該模型可較好地預測黃芪總黃酮提取量，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用于指導黃芪總黃酮的提取工藝。

2.4 黃芪總黃酮主要組分的含量

經(jīng)過HPD722大孔吸附樹脂和聚酰胺聯(lián)用富集后，黃芪總黃酮提取量可達310.63 mg·g-1，富集112倍，回收率分別為94.11%和80.19%；其主要組分毛蕊異黃酮和芒柄花素含量分別為42.56 和7.89 mg·g-1，分別富集327倍和132倍。

3 討論與結(jié)論

由于黃芪黃酮已在保健品、飼料方面被廣泛應用，其提取工藝研究已有文獻報道。肖衛(wèi)華等[24]最先用響應面法研究了黃芪總黃酮提取工藝，在提取溫度75 ℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分數(shù)88.3%，液固比 25 mL·g-1條件下，提取量為 0.98 mg·g-1。最近，劉少靜等[4]用單因素和正交試驗的研究表明，在乙醇體積分數(shù)85%，料液比(g∶mL) 1∶20，溫度80 ℃回流提取2.5 h條件下，黃芪總黃酮提取量可達2.39 mg·g-1。但上述工藝的提取量均低于本研究的2.78 mg·g-1，可見該工藝具有一定的推廣應用價值。

正交設(shè)計和均勻設(shè)計是在天然產(chǎn)物分離純化工藝研究方面應用較多的傳統(tǒng)設(shè)計方法。正交設(shè)計能在盡量減少試驗次數(shù)的情況下在多因素多水平組合中找出最佳因素水平組合，但不能給出因素和響應值之間明確的函數(shù)表達式，也不能全面地反映各因素之間的交互作用[25]。均勻設(shè)計最大化地追求均勻性達到減少試驗次數(shù)為目的，但是當試驗次數(shù)少于因素個數(shù)時，采用多重回歸的方法來研究響應變量隨自變量的變化的回歸方程就不是唯一的，而且其在試驗設(shè)計時不考慮全部交互作用，只有通過回歸分析時引入因素之間的交叉乘積項等來進行探索，因此，其結(jié)果不夠穩(wěn)定[5,25]。本研究采用Box-Behnken設(shè)計，共重復5個中心點，充分考慮了各因素間及各因素與響應值間的相互作用，提高了試驗精度，驗證試驗結(jié)果與模型預測值誤差僅為1.09%。本研究中乙醇體積比對提取結(jié)果的影響大于料液比，與劉少靜等[4]的研究結(jié)果一致。

表4 黃芪總黃酮主要組分的含量Table 4 Content of the main components in TFA of Astragalus membranaceus

大孔吸附樹脂和聚酰胺均是分離純化總黃酮類物質(zhì)的常用材料，但其吸附機理不同，各有優(yōu)缺點[26]。嚴柳葉等[27]和丁艷霞等[28]的研究表明，單純利用上述任何一種材料分離純化，總黃酮富集純化效果均不及大孔吸附樹脂和聚酰胺柱層析聯(lián)用。本研究選用HPD722弱極性大孔吸附樹脂和聚酰胺進行聯(lián)用富集，充分發(fā)揮了HPD722的弱極性與黃酮分子內(nèi)疏水部分有較強吸附作用的特點，以及聚酰胺可截留黃芪色素和部分脂溶性成分，且經(jīng)過水洗可除去部分水溶性雜質(zhì)等特點，較好地結(jié)合了兩者優(yōu)勢，得到良好的純化效果。本研究通過單因素試驗，研究了乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間對黃芪總黃酮提取量的影響，并采用響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，建立了回歸模型，表明在乙醇體積分數(shù)70%，料液比(g∶mL)1∶17，80 ℃提取70 min的條件下，黃芪總黃酮提取量可達2.78 mg·g-1；經(jīng)過HPD722大孔吸附樹脂和聚酰胺大孔吸附樹脂聯(lián)用富集后，黃芪總黃酮提取量可達310.63 mg·g-1，高于其他文獻報道[29]，富集倍數(shù)為112；其主要組分毛蕊異黃酮和芒柄花素含量分別為 42.56 mg·g-1和 7.89 mg·g-1，富集倍數(shù)分別為327倍和132倍。上述結(jié)果表明，該提取工藝和富集純化方法合理，可為黃芪總黃酮的提取和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。